伴神經內分泌分化結直腸腺癌中p53、Ki—67的表達及其與預后的關系

張海勇+酈秀芳+呂艷婷+胡孟鈞

[摘要] 目的 探討伴神經內分泌分化（NED）結直腸腺癌中p53、Ki-67的表達及其與預后的關系。方法 采用SP法檢測NSE、CgA、Syn、CD-57及p53、Ki-67蛋白在65例結直腸腺癌組織中的表達，分為NED陽性組35例和NED陰性組30例，并分析p53、Ki-67表達對預后的影響。結果 NED陽性組中p53、Ki-67陽性表達率均明顯高于NED陰性組（P<0.05）。p53、Ki-67的表達與淋巴結轉移、組織學分化和DUCK分期密切相關（P<0.05）。NED陰性組的5年生存率明顯高于NED陽性組（P<0.05）；NED陽性組中，p53表達陰性者和Ki-67表達陰性者的5年生存率明顯高于兩者表達陽性者（P<0.05）。Cox回歸分析表明，淋巴結轉移、DUCK分期、p53及Ki-67表達是患者5年生存率的獨立預后因素（P<0.05）。結論 p53、Ki-67的高表達可能在伴NED結直腸腺癌發生發展過程中起重要作用；兩者均為伴NED結直腸腺癌預后的獨立危險因素。

[關鍵詞] 結直腸腺癌；神經內分泌分化；免疫組織化學；p53；Ki-67 ；預后

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）24-0015-04

結直腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來隨著對其發病機制認識的提高、手術方式的進步及新治療手段的涌現和應用，結直腸癌患者得治療效果得到了很大的改觀，但患者總的5年生存率仍不理想[1，2]。目前發現，神經內分泌分化（NED）現象廣泛存在于一般的非內分泌組織、良勝腫瘤及惡性腫瘤組織中，且惡性腫瘤中以腺癌多見[3]。伴NED結直腸腺癌具有分化差、侵襲性強、轉移早等臨床病理特征，患者預后差、生存期短[4]。因此，探明其發病機制，尋找新的有效的相關診斷分子標志物和治療靶標，是提高患者治療效果、改善患者預后的關鍵，但目前國內對伴NED結直腸腺癌的相關研究報道相對較少。P53基因位于第17號染色體（17P13.1）的短臂上，約有50%的突變率。p53基因發生突變時，由抑癌基因轉為原癌基因，可促進細胞惡性轉化，其突變或缺失已經被證實是導致許多腫瘤發生的原因[5]。Ki-67是存在于細胞增殖期的蛋白質，在細胞凋亡中S、GM期均有表達，主要定位于細胞核，有助于了解細胞的增殖活性，且與多種腫瘤的發生、發展、浸潤、分期、轉移有關[6]。本研究應用免疫組織化學方法檢測p53、Ki-67在伴NED結直腸腺癌組織中的表達，探討二者表達與其臨床病理因素的關系及對預后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2005年1月～2007年12月我院手術切除且均經病理證實的結直腸腺癌組織石蠟標本65例，其中男33例，女32例；年齡29～70歲，平均43.4歲；管狀腺癌31例，乳頭狀腺癌14例，黏液腺癌20例；Dukes分期：A期10例，B期29例，C期14例，D期12例；有淋巴結轉移28例。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續4 μm切片。凡四種神經內分泌標志物中一種標志物陽性表達均視為NED陽性。按神經內分泌陽性表達情況將入選結直腸腺癌組織分為NED陽性組35例和NED陰性組30例，兩組年齡、性別、腫塊大小、腫瘤部位、組織學類型及治療情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2方法

采用免疫組織化學SP法檢測入選結直腸腺癌組織中神經內分泌標志物NSE、CgA、Syn、CD-57及p53、Ki-67蛋白的表達，SP試劑盒及NSE、CgA、Syn、CD-57、p53、Ki-67六種抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。操作程序按說明書進行。結果判斷：細胞胞漿或胞膜為棕黃色細顆粒者為神經內分泌標志物陽性表達。p53、Ki-67陽性表達定位于細胞胞核（圖1和圖2）。采用半定量評分法[7]，染色強度：0分，無色；1分，染色弱但明顯強于陰性對照；2分，染色清晰，中等程度；3分，染色程度強。陽性細胞數：0分，無陽性細胞；1分，陽性細胞≤25%；2分，陽性細胞占26%～50%；3分，陽性細胞占51%～75%；4分，陽性細胞>75%。上述兩項評分相加，0～1分為（-），2～3分為（±），4～5分為（+），6～7分為（++）；（-）和（±）判為陰性，（+）和（++）判為陽性。

1.3隨訪

通過門診或電話對65例結直腸腺癌患者進行隨訪，隨訪內容：總生存、死亡及腫瘤復發轉移。隨訪終止日期是2012年12月30日。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0版統計軟件進行數據分析。計數資料比較采用χ2檢驗，生存資料作Kaplan-Meier生存曲線，并行Log-rank檢驗和Cox多因素分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 p53、Ki-67在NED陽性組和NED陰性組中的表達

p53在NED陽性組和NED陰性組的陽性表達率分別為80.0%（28/35），26.7%（8/30）；Ki-67在NED陽性組和NED陰性組的陽性表達率分別為85.7%（30/35），40.0%（12/30）。NED陽性組中p53、Ki-67陽性表達率均明顯高于NED陰性組（P<0.05）。

2.2 伴NED結直腸腺癌組織中p53、Ki-67表達與臨床病理學特征的關系

p53、Ki-67在伴NED結直腸腺癌組織中的表達與淋巴結轉移、浸潤深度、組織學分化和DUCK分期密切相關（P<0.05）， 而與其他臨床病理學特征無關，見表1。

2.3 p53、Ki-67蛋白表達對伴NED結直腸腺癌患者預后的影響

本組均獲完整隨訪，隨訪率100.0%。NED陽性組5年或5年以上存活10例（28.6%，10/35），死亡25例（71.4%，25/35），5年總的生存率22.9%；NED陰性組5年或5年以上存活16例（53.3%，16/30），死亡14例（46.7%，14/30），5年總的生存率43.3%。經Kaplan-Meier生存率曲線及Log-Rank顯著性檢驗發現，NED陰性組的5年生存率明顯高于NED陽性組；NED陽性組中，p53表達陰性者的5年生存率明顯高于p53表達陽性者（P<0.05），Ki-67表達陰性者的5年生存率也明顯高于Ki-67表達陽性者（P<0.05），見圖3和圖4。

Cox回歸單因素分析顯示淋巴結轉移、浸潤深度、組織學分級、DUCK分期、p53及Ki-67陽性表達與伴NED結直腸腺癌患者5年生存率顯著相關（P<0.05）。Cox回歸多因素分析表明淋巴結轉移、DUCK分期、p53及Ki-67表達是伴NED結直腸腺癌患者5年生存率的獨立預后因素（P<0.05），而組織學分級未進入Cox回歸模型，見表2。

3 討論

1938年Feyrter提出在機體傳統內分泌腺以外存在一些NED細胞，能產生胺類、肽類及蛋白酶類激素，他們廣泛分布于肺、胃、腸等組織器官中。近年來國內外學者對伴有NED前列腺癌、乳腺癌、肺癌的相關研究較多，但對于結直腸癌中NED與結直腸癌預后的關系以及通過何種途徑影響預后等方面研究報道也相對較少。

p53是目前發現的與腫瘤相關性最密切的一種基因，分為野生型和突變型。野生型p53屬于抑癌基因，具有對細胞生長、凋亡、DNA 修復等的調控作用；而突變型p53不僅無抑癌作用，更具有促進細胞惡性轉化的活性功能。一旦p53發生基因突變，失去了其“分子警察”的重要抑癌作用，由抑癌基因轉變成癌基因，導致細胞的惡性轉化和癌變[8，9]。眾多資料顯示，P53在多種惡性腫瘤組織呈高表達，可能參與腫瘤發生的過程[10-13]。Ki-67是一種敏感的判斷細胞增殖活性的核抗原，能較可靠地檢測良性、惡性組織的生長狀態，已經成為應用最廣泛的增殖細胞標記之一。目前有研究表明在多種實體惡性腫瘤中均有Ki-67的異常表達，其表達遠高于正常組織，并與惡性腫瘤的種植、浸潤、轉移潛能及預后密切相關[14，15]。

本研究結果發現，伴NED結直腸腺癌組織中p53、Ki-67陽性表達率均明顯高于NED陰性結直腸腺癌組織（P<0.05），且p53、Ki-67在伴NED結直腸腺癌組織中的表達與淋巴結轉移、浸潤深度、組織學分化和DUCK分期密切相關（P<0.05），表明p53、Ki-67的高表達不僅可能參與了結直腸腺癌發生的過程，也可能在伴NED結直腸腺癌發生發展過程中起重要作用，同時也對伴NED結直腸腺癌的惡性增殖、淋巴結轉移、浸潤潛能等惡性臨床病理特征有重要影響[16，17]，有望成為評估伴NED結直腸腺癌的生物學行為的參考分子指標。

NED對腫瘤患者預后的影響一直是人們關注的焦點，但一直存在較多的爭議。目前多數認為出現伴有NED的腺癌預后差，易發生淋巴結，侵襲性強，器官轉移早。本組研究資料中，隨訪結果顯示NED陽性組5年總的生存率22.9%，NED陰性組5年總的生存率43.3%，NED陰性組的5年生存率明顯高于NED陽性組，進一步證明了伴神經內分泌分化的結直腸腺癌預后差，提示NED對結直腸腺癌患者預后具有重要影響。同時本組研究結果還顯示，伴NED結直腸腺癌中，p53表達陰性者的5年生存率明顯高于P53表達陽性者（P<0.05），Ki-67表達陰性者的5年生存率也明顯高于Ki-67表達陽性者（P<0.05）。Cox回歸多因素分析結果提示p53及Ki-67表達與淋巴結轉移、DUCK分期等一樣，是伴NED結直腸腺癌患者5年生存率的獨立預后因素（P<0.05）。說明P53和（或）Ki-67表達陽性者，其轉移、浸潤的風險更高，生存期短，預后不良。因此p53和Ki-67可能成為判斷伴NED結直腸腺癌患者預后的新分子指標，通過聯合檢測p53、Ki-67在伴NED結直腸腺癌中的表達情況，將有助于臨床對患者的預后判斷；同時深入研究兩者的確切活性功能，將為進一步探討伴NED結直腸腺癌發病機制開辟了新思路，并對臨床判斷伴NED結直腸腺癌患者預后以及制定術后治療方案具有重要實用價值。

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（收稿日期：2013-12-16）

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（收稿日期：2013-12-16）