基于時間－反應法評估半數死亡時間

徐鏡波，李鑄衡，李 爽

（東北師范大學環境學院，濕地生態與植被恢復國家環保部重點實驗室，吉林 長春 130117）

水生生物的急性和慢性致死試驗具有相對廉價和容易操作、可以很快地獲得數據的優點，因而在過去的幾十年里，這些試驗構成了化學物質毒性評價、環境管理的基石，在確定點源污染效應和比較物質毒性方面起到了很大的作用.然而，目前大多數實驗室對于受試化合物的暴露研究，通常是受試生物在整個實驗中被暴露在持續恒定的受試化合物濃度中，這種穩定的暴露條件不可能完全切合野生物種的現實暴露狀態［1］.因此，由上述這種廣泛應用的經典方法——“持續恒定濃度暴露”獲得的半致死或半效應劑量／濃度，在某種程度上也具有許多局限［2－3］.

水生生物總是暴露于各種環境污染物隨時間變化的波動起伏中.表面水的流失和相關的水解稀釋、擴散激流的沉淀析出，以及環境污染物活性的降解都能夠產生脈沖式暴露.因此一個簡單的時間－不變的暴露模式不太可能代表水生生物在自然生境中所遭遇的不斷波動變化的環境濃度.準確地度量暴露時間的效應對于評價污染物生態毒理方面的結果是非常重要的.為了達到這一目的，本文利用時間－反應法（time－response approach）為劑量／濃度－反應方法做補充，探討污染物脈沖式暴露的水生態毒理效應.在時間－反應方法中，測量的是死亡時間，從每個暴露濃度梯度中獲得更多的數據，因此提高了統計效能.雖然有這么多明顯的優點，生態毒理學者目前仍然未對時間－反應方法充分加以利用［4］.本文基于時間－反應法，重點闡明、評估了水生生物污染暴露的半數死亡時間（median lethal time，LT50，T50）的模型基礎與數據擬合的方法.

1 時間－反應法

1.1 死亡時間

為了準確地度量暴露的時間效應，時間－反應方法測量的是死亡時間（TTD，time to death），即從每個污染暴露的實驗中能夠獲得更多的數據，因此提高了統計效能，對于評價污染物生態毒理效應也是極其重要的.例如，在盛有10條魚的暴露容器中，可以得到10條魚的10個死亡時間——TTD值，而不只是一個比例.

存活時間法觀察的終點——死亡時間是與每個個體相關的，是把效應作為暴露時間和濃度的共同函數來加以預測.圖1顯示了發生在6個不同濃度下的理想化的死亡比例時間進程［4］.如果圖1中只用96h的實驗數據，LC50的計算僅僅用了5個點；如果觀察記錄個體的死亡時間數據而不僅僅是死亡比例，則可以產生更多的數據點，提高了統計效能［4］.

1.2 時間－反應數據的擬合

基于死亡時間概念和時間－反應的相關模式，建立分析時間－反應數據的方法.觀察記錄的個體實驗數據可以被直接運用或者經過轉換.通常，轉換的目的是使時間和反應之間的關系呈線性［4］.在生物毒性試驗中，測量數據或經過轉換的測量數據，即時間以及效應的測量數據都可以用于時間－反應數據的分析.

圖1 死亡率與死亡時間的關系

半致死時間LT50值及相應置信區間是由時間－反應模型得出的最常用的統計量.LT50是在預定的濃度下導致50%被暴露個體死亡的時間.概率單位（Probit）轉換來自于正態等差（normal equivalent deviation，NED），即以距正態曲線平均值的標準差數表示的死亡比例.首先，觀察記錄在一系列暴露時間下被暴露個體反應的比例.以反應比例的概率單位t值對暴露時間的對數作圖，可以生成一條如圖2所示的直線［4］.

圖2 死亡率、概率單位與時間的關系

LT50值及相應置信區間估計的步驟如下：

首先，觀察記錄個體的死亡時間數，列出在一系列暴露時間下被暴露個體反應的比例.以反應比例的概率單位值對暴露時間的對數作圖，以生成一條如圖2的直線.用目測法在這些數據上畫一條直線，導致50%死亡率的概率單位值對應的時間就是估計的LT50.

第二，計算95%置信區間.和劑量－反應數據一樣，死亡隨時間的分布可以從圖2中的一系列數據選擇.估計LT50的方法是一種半圖解法［4］.如圖3所示，線上對應于16%，50%和84%死亡率的點用來估計LT50及其95%置信區間.相應于P＝0.50的時間對數值的反對數就是 LT50.斜率因子（S）由16%（LT16），50%（LT50）和84%（LT84）死亡率的相應時間計算得出［4］：

圖3 時間－反應關系

式中：S為斜率因子；a為16%死亡率的時間（LT16值）；b為50%死亡率的時間（LT50值）；c為84%死亡率的時間（LT84）.

用從這條線得出的斜率因子來計算95%置信區間.式中，LT16，LT50和LT84分別是16%，50%和84%暴露個體死亡時對應的時間.然后計算f值（用S以及處理中在LT16和LT84之間被暴露的動物總數N求得），估計LT50值的95%置信上下限：

2 水生生物污染暴露的半數死亡時間

受試化合物為第二松花江典型污染物鄰二硝基苯（1，2－DNT），污染暴露的受試水生生物為敏感鯉魚幼魚.根據預試驗及LC50值結果，被測物濃度梯度設置為5.6，4.2，3.2mg／L，基于時間－反應法評估的水生生物污染暴露半數死亡時間（LT50）的測定結果如表1所示.

表1 實驗數據

LT50及相應置信區間估計的步驟如下：

（1）將死亡時間轉換為死亡時間的對數值（見表1）.

（2）利用概率單位換算表（見表2），將死亡百分數轉換成概率單位.

（3）根據概率單位作圖法，將死亡時間對數和死亡百分數轉換成的概率單位作圖，順著繪出點分布趨勢作一條直線.將表1中5.6，4.2，3.2mg／L濃度組的死亡時間對數（x）和死亡百分數概率單位（y）作圖；或者進行兩者的直線回歸方程分析.

（4）如圖2（右圖）、圖3，從縱軸的概率單位為5處作一平行于橫軸的平行線，與所作直線必有相交之“點”，再自這“點”作橫軸的垂線，交橫軸之點所對應的值即為LT50的對數.最后，查反對數，得到5.6，4.2，3.2mg／L質量濃度下的LT50值分別13.10，39.20，110.10min（見表1）.

（5）同時，求直線的回歸方程，也就是時間與反應關系的回歸方程.依據SPSS17.0得到死亡時間對數（x）和死亡百分數轉換成的概率單位（y）的直線回歸方程和LT50值：

直線回歸方法獲得的5.6，4.2，3.2mg／L濃度下的LT50值分別13.46，39.77，112.26min，與表1中用概率單位作圖法獲得的三個濃度下的LT50值相同.

（6）求LT50的置信限.按式（1）和（2），求斜率因子（S），f，得到LT50的置信限：

5.6mg／L濃度組LT50的置信限：10.68～16.96min.

4.2mg／L濃度組LT50的置信限：32.33～48.92min.

3.2mg／L濃度組LT50的置信限：80.40～129.68min.

表2 概率單位換算表

3 結語

由于現今標準恒定暴露的毒性實驗測量的局限，傳統的實驗室毒性實驗迄今為止幾乎不能特定地完成現實環境中時間－改變的暴露效應評價.本文基于時間－反應法，介紹了鯉魚幼魚暴露于1，2－DNT的LT50數據擬合與處理方法.期望隨著與傳統劑量或濃度－反應試驗方法（LD50／LC50或ED50／EC50）能有效結合，進一步豐富生態毒理學的研究內容.

［1］HYNDMAN K M，BIALES A，BARTELL S E，et al.Assessing the effects of exposure timing on biomarker expression using 17β－estradiol［J］.Aquatic Toxicology，2010，96：264－272.

［2］DIAMOND J M，KLAINE S J，BUTCHER J B.Implications of pulsed chemical exposures for aquatic life criteria and wastewater permit limits［J］.Environmental Science and Technology，2006，40：5132－5138.

［3］ZHAO Y，NEWMAN M C.Shortcomings of the laboratory－derived median lethal concentration for predicting mortality in field populations：exposure duration and latent mortality［J］.Environmental Toxicology Chemistry，2004，24：2147－2153.

［4］NEWMAN M C，UNGER M A.Fundamentals of ecotoxicology［M］.USA：Lewis Publishers，2003.