酸響應聚合物-鉑共軛納米顆粒給藥載體的抑癌作用

梁濤

(鄭州大學第一附屬醫院藥劑科，鄭州 450052)

順鉑已經廣泛應用于臨床治療各種癌癥，其藥理作用機制是阻止雙螺旋的解螺旋和分離，阻止細胞的分裂并最終導致細胞凋亡[1-3]。然而，65% ～98%的順鉑與血漿蛋白結合，導致藥物失活，降低順鉑治療效果[4-6]。另外，多數抗腫瘤藥物具有極高的生物毒性且缺少特異選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會影響到正常對照組織細胞[7-10]。為提高藥物靶向性，筆者應用酸響應的聚合物-鉑共軛的納米體系，將順鉑負載聚合物納米顆粒(nanometer particle，NP)中[11]，合成具有酸響應特性的藥物載體，在酸性環境的腫瘤部位下釋放出藥物，從而延長藥物半衰期，并且可以同時遞送兩種或更多藥物用于聯合治療以便產生協同作用，并降低耐藥性[8]，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 羥基-聚乙二醇-聚肥酸共聚物(HOOCPEG-PLA-NH-NH2，參照文獻[12]合成)，四氯鉑酸鉀(K2PtCl4)以及其他用于化學合成順鉑的試劑購買自Sigma-Aldrich，細胞培養試劑和培養液購買自Media Tech，噻唑藍(thiazolyl blue，MTT)細胞增殖測定試劑盒購自美國普洛麥格公司。A2780人卵巢癌細胞由UCSD Moores癌癥中心Stephen Howell博士提供。

1.2 方法

1.2.1 合成 PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2首先按照文獻合成PtCl2(OH)2(NH3)2，之后用其合成PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2[13]。將過量的乙酰丙酸酐于回流下加入到含有PtCl2(OH)2(NH3)2100 mg(0.3 mmol)的丙酮溶液中，反應12 h后，加入冷水水解過量的酸酐，將反應混合物于2℃下放置16 h。在減壓下除掉丙酮，得到白色殘渣，將殘渣分別用水、乙醇和乙醚進行洗滌而純化，得到最終產物，產率為39.0%。

1.2.2 聚合物-順鉑前體藥物共軛體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的合成 將HOOC-PEG-PLA-NH-NH2與PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2以劑量比1∶8溶解在二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺溶液(體積比1∶1)30 mL中，于氮氣(N2)氛圍中50℃回流狀態下反應48 h。將粗產物在乙醚中反復沉淀進行純化，隨后用水和三氯甲烷進行萃取。將得到的純化的Bi(PEGPLA)-Pt(IV)保存在－20℃備用。其產率為28.3%。

所合成的共軛體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的核磁表征數據為:1H NMR(CDCl3，400 MHz):1.2(t，3 H，J=7.0 Hz)，1.55(m，3H)，2.1(s，3H)，2.9(d，2H，J=2.8 Hz)，3.47(q，2H，J=7.0 Hz)，3.63(m，2H)5.15(m，1H)，8.0(br，3H)，8.2(br，1H)。

1.2.3 聚合物-順鉑前體藥物共軛體NP的制備 NP通過納米沉淀的方法制得。將Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體10 mg溶解在乙腈3 mL中并在連續攪拌下加入到含水10 mL的小瓶中。當納米沉淀完成后，將有機溶劑除去。之后將NP溶液用截留相對分子質量為104的Amicon Ultra-4離心過濾器(Millipore Billerica，MA)過濾3次。得到的納米顆粒的形態和大小利用掃描電鏡進行表征。

1.2.4 藥物負載和藥物釋放研究 為了研究順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的釋放，將制備的NP溶液100 μL放入截留相對分子質量3.5×103的 Slide-ALyzer MINI滲析管中，之后于37 ℃在pH=5.0，6.0 和7.4 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)緩沖溶液中滲析，每隔12 h更換PBS。在每個預定時間點從3個小滲析單元中采集NP溶液用于藥物含量量化以及順鉑濃度量化。

1.2.5 聚合物降解研究 將聚合物NP在pH=5.0，6.0，7.4的PBS中于37℃下溫育，測定聚合物降解。在每個時間點采集NP樣品，利用三氯甲烷萃取，并在冰冷的乙醚下再次沉淀。利用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)來確定聚合物相對分子質量的變化。

1.2.6 包封率、載藥量和藥物利用率 采用葡聚糖凝膠過柱的方法分離被包裹藥物和游離藥物。此法是利用葡聚糖凝膠的分子篩作用，將納米粒大分子與游離藥物小分子分離，計算公式為:包封率(entrapment rate，ER)=WL/WT ×100%;載藥量(drug loading，DL)=WL/WP ×100%;藥物利用率(recovery，R)=WT/WD×100%(WT:藥物總量，WL:包裹于納米粒中的藥物量，WP:制備納米粒時 PLGA注藥量，WD:藥物用量)，聚合物 NPER、DL、R 分別為:11.24%，1.25% 和99.43%。

1.2.7 細胞毒性分析 應用 MTT檢測法評估 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對A2780人卵巢癌細胞的細胞毒性，首先將A2780人卵巢癌細胞接種在96孔板內(細胞密度每孔2×104個)，培養24 h。然后更換新鮮培養液150 μL，并加入Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP溶液50 μL，培養4 h后去除過量的NP，用新鮮培養液洗滌細胞3次后加入新鮮培養液。繼續培養72 h后通過MTT試劑測定細胞存活情況。新鮮細胞培養液和PEG-PLA NP作為陰性對照，各濃度下的游離順鉑作為陽性對照[13]。

1.2.8 統計學方法 利用統計學分析評估Bi(PEGPLA)-Pt(IV)共軛體NP對A2780人卵巢癌細胞增殖的影響，利用t檢驗對連續數據進行組間比較，并用Kaplan-Meier方法進行生存率分析，統計學分析軟件為NCSS 97版，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP形態表征 從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP的掃描電鏡圖中(圖1)，可以看出所形成的納米顆粒呈現較均一的膠束形態，其粒徑為(82.0 ±3.0)nm，粒徑 ＜100 nm，這與相應的PEG-PLA聚合物NP所呈現的粒徑相似。

圖1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP的掃描電鏡圖(×200)Fig.1 Scanning electron microscope image of Bi(PEGPLA)-Pt(IV)conjugate NP(×200)

2.2 藥物負載、釋放以及聚合物的降解 利用電感耦合等離子體光發射譜測定NP的順鉑負載率(即負載到NP中的順鉑占加入順鉑總量的比例)。根據藥物釋放動力學，分別以順鉑負載率和時間為縱橫坐標軸作圖，見圖2所示，在聚合物-前體藥物共軛體制備過程中加入的Pt(IV)前體藥物越多，其順鉑的藥物負載率就越高。初始Pt(IV)/PEG-PLA反應比為2∶1，4∶1和6∶1時，得到的順鉑藥物負載率分別為(0.35 ±0.01)%，(0.89 ±0.02)%和(1.05 ±0.03)%(P＜0.01)。當Pt(IV)/PEG-PLA的摩爾比高于6∶1時，藥物負載率無顯著升高跡象。

圖2 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP在各種初始Pt(IV)/PEG-PLA反應摩爾比下的順鉑負載率Fig.2 Cisplatin loading yield of Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs at various initial Pt(IV)/PEG-PLA reaction molar ratios

順鉑在3 個不同的 pH(5.0，6.0 和7.4)時的釋放動力學曲線見圖3，順鉑在pH=5.0和6.0時的釋放率顯著高于pH=7.4的釋放率。當順鉑負載率為1.05%時，pH=5.0和6.0的環境中 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP釋放50%的藥物時分別需要4和6 h，在pH=7.4時需要22 h。該釋放量的差別在藥物開始釋放的最初幾個小時最為明顯——在開始的前2 h內，pH=5.0和6.0時順鉑釋放率分別為17%和15%，而在pH=7.4時僅為2%。

圖3 順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的釋放曲線Fig.3 Cisplatin release profile from Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs

選定不同的時間點，分別采集PEG-PLA NP樣品，利用GPC來測定聚合物的相對分子質量，見圖4所示，培養50 h 后，在 pH=5.0，6.0 和7.4 時，聚合物相對分子質量分別降低20%，18%和8%，驗證了PLA作為生物可降解聚合物，在中性和酸性環境中可水解為較小的片段或單體。

圖4 PEG-PLA NP 在 pH 5.0，6.0 和7.4 時的降解率Fig.4 Hydrolytic degradation rate of PEG-PLA NPs at pH 5.0，6.0，and 7.4

2.3 細胞毒性分析結果 本實驗選取A2780人卵巢癌細胞作為模型癌細胞，通過MTT檢測法檢測了 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的體外細胞毒性。培養4 h后Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的細胞生存能力降低至65%(P＜0.01)，而PEG-PLA NP對卵巢癌細胞的細胞毒性可忽略不計，同樣細胞培養液對照組也未顯示出明顯的細胞毒性。在10，50 和 100 μmol·L－1下的游離順鉑的細胞生存能力分別為99%(P＜0.05)，62%(P＜0.01)和35%(P ＜0.01)。另外在本實驗中包裹在Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的鉑化合物只相當于7 μmol·L－1游 離 的 順 鉑，然 而 卻 起 到 了 與50 μmol·L－1游離的順鉑的細胞毒性效果。可見酸響應藥物載體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP顯著提高了藥物的生物利用度。然而筆者并未對Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對正常細胞的影響進行研究，這是有待完善之處。

3 討論

隨著靶向治療的深入，納米藥物載體在腫瘤治療中顯示出廣闊的應用前景。PEER等[14]將多柔比星通過可酸解的腙鍵共價結合到聚乙二醇聚合物上，其中連接多柔比星與聚合物的腙鍵響應于pH的刺激，從而延長多柔比星在血液中的循環時間，并且由于增強滲透滯留效應使得更多的多柔比星在腫瘤處聚集，減少了不良反應，在上述研究的基礎上，筆者對順鉑的納米囊進行了研究，以提高順鉑的生物利用度和治療效果。

結果發現，本研究合成的Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的粒徑＜100 nm，符合對體內藥物載體材料的大小要求，能夠有效地逃脫體內清除機制，提高藥物的生物利用度。同時，該共軛聚合物納米粒徑與未共軛順鉑的PEG-PLA NP所形成的粒徑差別不大，說明共軛順鉑之后并沒有影響聚合物NP的形成。藥物負載實驗顯示，初始Pt(IV)/PEG-PLA反應摩爾比增加到8∶1時，聚合物鏈與順鉑的結合已經達到飽和狀態，所有PEG-PLA聚合物已經全部與Pt(IV)發生共軛，藥物負載率沒有顯著提高。藥物的釋放實驗表明，順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的釋放是pH依賴型的，這主要是由于順鉑是通過腙鍵而共軛于聚合物鏈上的，而腙鍵是一種酸響應鍵。在pH=5～6時，腙鍵可在幾分鐘內迅速斷裂以釋放出藥物，從而使藥物從NP中擴散出來。在pH=7時，腙鍵相對穩定，所觀測到的順鉑釋放，可能是由于共軛連接順鉑前體藥物的可降解聚合物PLA的降解造成的。通過上述實驗可得出結論，在3種pH下培養24 h后聚合物相對分子質量的降低水平幾乎可以忽略不計，即最初的二十幾個小時內藥物的迅速釋放是由于腙鍵的斷裂而不是聚合物的降解。細胞存活實驗顯示Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP能夠明顯地降低A2780人卵巢癌細胞的細胞存活率，并且其所共軛順鉑藥物量只相當于7 μmol·L－1游離順鉑藥物，卻可以達到與50 μmol·L－1游離順鉑藥物的細胞毒性的效果，證實了Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對A2780人卵巢癌細胞具有較高的細胞毒性，且顯著提高了順鉑的生物利用度。其機制主要為:采用納米模式能將化療藥物在準確的時間遞送至病變部位，并保證藥物具有足夠長的作用時間。更為重要的是腫瘤細胞膜上P糖蛋白的過表達可以阻止藥物進入細胞，同時還能將部分進入細胞內的藥物泵出，這是腫瘤耐藥的重要機制[15]，而采用納米封裝技術的藥物能夠避開腫瘤細胞膜上高表達的跨膜蛋白(P糖蛋白)的識別，不僅可將藥物分子靶向轉運到特定的細胞或器官，還可遞送細胞難以攝取的生物大分子藥物(如核酸、蛋白質)至細胞內的活性部位，提高了治療的效率[16]。

綜上所述，本研究合成的新型酸響應Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-順鉑前體藥物共軛NP可以作為一種新的順鉑藥物遞送載體，具有良好的酸響應釋放動力學表現，能夠增強對癌癥細胞的細胞毒性作用。同時增強藥物靶向性，降低對其他組織細胞的毒副作用。與國內外文獻報道的繁瑣的屏蔽-去屏蔽保護方法相比，更具有可行性。這種新型酸響應Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-順鉑前體藥物共軛NP有望成為更優良的抗腫瘤制劑，為新型功能化藥物運載系統的研究奠定基礎。

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