HPLC法測定眼用伏立康唑納米結晶混懸液含量

戴助 (長江大學臨床醫學院 荊州市第一人民醫院藥學部，湖北 荊州 434000)

眼部真菌感染是一種缺乏特異有效治療方法、嚴重威脅視力的眼部感染性疾病，臨床局部藥物治療缺乏敏感是該病治療失敗的主要原因［1］。伏立康唑作為新型第三代抗真菌藥對多種眼部致病真菌具有更強抗菌活性 (例如其體外抗菌活性是氟康唑的50～100倍)［2］，在臨床上有著不可替代的地位。為了解決伏立康唑的溶解性能、增加眼部用藥的生物利用度，本課題組前期構建了穩定的伏立康唑納米結晶混懸液。本文采用高效液相色譜法 (HPLC)測定此產品中伏立康唑含量，為下一步伏立康唑眼用制劑的開發提供理論依據。

1 儀器與試劑

Dionex P680高效液相色譜儀:四元泵、紫外檢測器、Chromeleon色譜工作站 (美國);Hypersil C18色譜柱 (大連伊利特);伏立康唑對照品 (批號:090621)，0.5%伏立康唑納米結晶混懸液 (實驗室制備);甲醇、乙腈 (ThermoFisher色譜純)，磷酸二氫銨、氨水均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

參考HPLC測定伏立康唑的文獻［3-5］，對流動相比例進行調整，確定流動相為0.04mol/L磷酸二氫銨溶液 (用氨水調節pH值至6.0)-乙腈 (60∶40)，流速為1.0ml/min;色譜柱為Hypersil ODS C18色譜柱 (4.6mm×150mm，5μm)，進樣量為20μl;取濃度為 20μg/ml的伏立康唑對照品溶液在190～450nm范圍內進行紫外掃描，結果顯示在256 nm處伏立康唑有最大特征吸收，確定紫外檢測波長為256nm。

2.2 專屬性考察

按“2.1”項下色譜條件，將伏立康唑對照品和伏立康唑納米結晶混懸液樣品分別進樣測得色譜圖(圖1)，從圖1可知對照品與樣品中伏立康唑主成分峰保留時間一致，樣品中雜質峰對主成分峰無干擾，分離度大于3.0。

圖1 伏立康唑對照品 (a)和伏立康唑納米結晶混懸液 (b)色譜圖

2.3 線性試驗

精密稱定伏立康唑對照品適量，采用流動相溶解并稀釋至刻度配制成濃度為10mg/ml的對照品貯備液。精密量取對照品貯備 液 2.5、5、10、20、50、100、200、300μl 于10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件進樣。以伏立康唑峰面積(A)對其濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程:A=0.3289C+0.3699，R2=0.9998，線性范圍為2.5 ～200μg/ml。

2.4 干擾試驗

為了考察納米結晶混懸液中輔料是否干擾伏立康唑的測定，取空白納米結晶混懸液適量加流動相稀釋至一定濃度，按“2.1”項下色譜條件進樣，色譜圖結果顯示納米結晶混懸液中輔料對樣品中伏立康唑含量測定沒有干擾。

2.5 精密度試驗

精密吸取伏立康唑納米結晶混懸液樣品一定量，加流動相稀釋20倍后，按“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，以伏立康唑峰面積計算，結果RSD為3.35%(n=5)。

2.6 穩定性試驗

取濃度為200 μg/ml的伏立康唑對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣，1日內測定5次，以及每日測定1次，連續測定3d，得日內與日間RSD值分別為2.28%和5.57%(n=5)。

2.7 回收率試驗

用流動相配制高、中、低三種濃度的伏立康唑對照品溶液，按“2.1”項下方法分別測定樣品中伏立康唑的含量，每組濃度平行操作3次計算平均回收率 (表1)。從表1可知低、中、高濃度回收率分別為98.15%、104.41%和96.41%，RSD分別為0.45%、0.56%和0.32%。

2.8 樣品含量測定

分別精密量取3個批號的伏立康唑納米懸浮液0.2 ml(約相當于伏立康唑1 mg)，置于50 ml量瓶中加流動相稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣，采用外標法計算樣品中伏立康唑的含量，結果見表2。

表1 回收率試驗結果

表2 伏立康唑納米結晶混懸液含量測定

3 討論

在專屬性試驗中，檢出伏立康唑納米結晶混懸液樣品雜質對伏立康唑主成分峰的吸收沒有干擾。從HPLC系列方法學研究可見，該HPLC法簡便、快速、專屬性強，可用于伏立康唑納米結晶混懸液的含量測定。

［1］Shivaprakash MR，Apannanavar SB，Dhaliwal M，et al.Colletotrichum truncatum:an Unusual Pathogen Causing Keratitis and Endophthalmitis［J］.Clin Microbiol，2011，49(8):2894-2898.

［2］Hariprasad SM，Mieler WF，Lin TK，et al.Voriconazole in the treatment of fungal eye infections:a review of current literature［J］.Br J Ophtbalmol，2008，92:871-878.

［3］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典 (二部)［S］.北京:化學工業出版社，2010.

［4］姚毅，唐燕平.HPLC法測定注射用伏立康唑含量及有關物質［J］.藥學進展，2005，29(12):562-565.

［5］糜志遠，石磊，張迎慶.高效液相色譜法測定伏立康唑膠囊含量研究［J］.湖北工業大學學報，2011，26(5):47-49.