LIMK1表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系

王曉英 屈昌民 梁淑文 李連勇 宮淑娟 翟靜妤 王寶艷

結腸癌(colon cancer)是消化系統的常見惡性腫瘤，發病率和死亡率均呈逐年上升的趨勢。尋找結腸癌浸潤、侵襲和轉移的分子機理，尋找關鍵標記，對早期診斷、靶向干預治療和預后判斷有非常重要的意義。有大量報道表明[1]，LIM激酶(LIM kinase,LIMK)在胃癌、前列腺癌和肝癌等惡性腫瘤組織中均有高度表達，但尚無明確的結腸癌研究報告。我們通過自制組織芯片技術檢測LIMK1蛋白在結腸癌組織中的表達，從而研究其臨床病理價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010-2013年本院行外科手術切除的結腸癌組織68例、上皮內瘤變17例以及遠離結腸癌的正常組織標本31例，合計116例。全部患者術前都行HE病理組織活檢得到確診，且尚未接受放、化療治療。結腸癌患者中男性43例，女性25例，≥65歲者42例，<65歲者26例；低分化腺癌21例，中分化腺癌43例，高分化腺癌4例；TNM分期：Ⅲ期及以上者37例，Ⅰ+Ⅱ期31例；腫塊直徑<3 cm者24例，≥3 cm者44例；無淋巴結轉移33例，淋巴結轉移35例。

1.2 組織芯片制作

依據HE病理組織切片確定有代表價值的典型病變部位，自制組織芯片。采用Beecher Instruments生產的組織芯片儀和2 mm組織穿刺針。基本流程大致如下：①制備組織芯片模塊：將蜂蠟和萊卡石蠟以7∶3的比例混合起來，制備成2.2 cm×3.5 cm×1.0 cm的蠟塊，同時設計5×10點組織列陣，并通過芯片儀打孔做成帶孔的空白蠟塊。②制備組織芯片：在40～41 ℃水浴中軟化蠟塊2 min，選取病變部位，逐步拿出2 mm×3 mm的組織柱，并相繼推入預先設計的空白蠟塊孔內，排列成組織芯片，并將組織芯片面朝下置于玻片上，在37 ℃恒溫中靜置半小時，輕輕按壓玻片使得組織柱能夠在模塊中排列平整。

1.3 免疫組化染色

使用美國ABZOOM公司生產的LIMK1單克隆抗體(ab55414)，SP通用試劑盒、0.1 mol/L(pH6.0)PBS、0.01 mol/L(pH6.0)檸檬酸鹽抗原修復液、DAB酶底物顯色試劑盒和EDTA修復液均購自福州邁新公司，主要的操作流程則依據試劑盒說明進行。

1.4 結果判定

LIMK1陽性表達定位在細胞質或細胞核，并且呈現棕黃或者棕褐色。依據陽性細胞的染色程度和染色細胞的百分比量化計分：深棕色為2分，淺棕色為1分，未著色為0分；染色陽性細胞率>50%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，<5%為0分。在最終統計中，將兩項分值相加：其中>4分為強陽性(+++)，3分為陽性(++)，2分為弱陽性(+)，1分為陰性(-)。并將PBS作為陰性對照，而以結腸癌陽性表達切片作為陽性對照。

1.5 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，不同組間比較采用χ2檢驗，組間等級資料比較采用行×列表χ2檢驗，P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片制備結果

在此次研究中共制備3個5×10組織芯片蠟塊，均通過規則的點陣方式植入相同直徑的組織樣本中，并且點陣排列規整，其形態可觀測率達到96.38%。

2.2 LIMK1蛋白在不同結腸組織中的表達

LIMK1在5例遠離結腸癌的正常組織中呈弱陽性，且主要位于結腸淺表黏膜。在結腸上皮內瘤變中呈強陽性4例，陽性3例，較正常黏膜組織表達水平有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。而LIMK1在高級別上皮內瘤變中表達則顯著高于正常黏膜組織(P<0.05)。LIMK1在結腸癌患者病理切片中主要呈中～強陽性，其中強陽性14例，陽性33例，弱陽性8例，顯著高于正常黏膜和腺瘤。見表1。

表1 LIMK1在不同結腸組織中的表達(例，%)

2.3 LIMK1表達與結腸癌臨床病理參數的關系

研究結果表明，LIMK1的表達與患者的年齡、分化程度無關，與腫瘤的大小、淋巴結是否轉移以及TNM分期有關。見表2。

表2 LIMK1表達同結腸癌臨床病理參數的關系(例，%)

3 討論

LIMK1基因長度為39499 bp，位于染色體7q11.23,RNA編碼LIMK1蛋白，在惡性腫瘤細胞的浸潤、侵襲和轉移中發揮重要作用，并參與機體生長調節、細胞骨架重建以及腫瘤形成[2-3]。LIMK1屬于絲氨酸蛋白激酶，通過磷酸化能夠促使微管解聚，從而有利于腫瘤細胞侵襲。腫瘤細胞在侵襲過程中表現為“邊緣隆起-黏附-回縮”周期性活動，從而使得細胞能夠“前進”，因而形成“侵襲性偽足”，由肌動蛋白聚合形成微絲系統。絲切蛋白(cofilin)和肌動蛋白解聚因子家族(actin depolimeriaing factor,ADF)在微絲的形成和解聚中發揮重要作用。LIMK1能夠將位于cofilin/ADF蛋白第3位的絲氨酸磷酸化，致使其無法解聚肌動蛋白，從而促使偽足形成，產生腫瘤細胞的移動。有研究表明[4]，LIMK1致使cofilin蛋白磷酸化與去磷酸化間的平衡發生輕微的變動是決定腫瘤細胞遷移侵襲能力的關鍵。

有臨床研究證實[5]，LIMK1在不同類型的惡性腫瘤中均大量表達，如人惡性膠質瘤細胞和人肺癌H1299細胞等，并以不同的機理和方式發生浸潤、侵襲和轉移。同其它正常的前列腺上皮細胞P69和BPH-1比較，前列腺M21和M12細胞中LIMK1表達水平隨著惡性腫瘤發展而增加，M21和LNCaP細胞中LIMK1表達高1～2倍，而轉移性DU145和PC3則要高出7～8倍。此外，高侵襲性的M21和PC3細胞中LIMK1水平普遍高于低侵襲性細胞。轉移的前列腺癌細胞中存在高度磷酸化的絲切蛋白，通過抑制LIMK1的表達，使得腫瘤細胞遲滯在G2/M期，改變細胞生物學特性，改變其正常形態，遏制細胞增殖和分化，從而遏制轉移性前列腺癌細胞的侵襲性。此外，有報道顯示[6-7]，前列腺癌中與浸潤和轉移相關的基因位點位于7q11.2，而人類LIMK1基因位點7q11.23，表明兩者具有一定程度的關聯。LIMK1在人乳腺癌細胞中高表達，則顯著增強腫瘤細胞的侵襲能力，血液轉移和肝肺轉移的風險高度增加。

有學者通過免疫組化顯示[8]，LIMK1在絕大多數乳腺腫瘤細胞中大量表達，并且超過50%在細胞核中表達，而正常乳腺細胞中僅有不到40%在細胞質中表達，且進一步證據表明，LIMK1能夠促進乳腺腫瘤細胞的侵襲能力。Chhavi等[9]采取Western blot法檢測子宮頸正常組織、子宮頸癌組織和上皮內瘤變中LIMK1的表達水平。結果表明，宮頸癌組織中LIMK1含量高于健康組織和CIN的5倍和2倍。而LIMK1高度表達的患者死亡率為53.85%,顯著高于LIMK1低表達患者的17.63%，表明LIMK1表達水平不僅與子宮頸癌的侵襲能力呈正相關，而且影響患者的預后。

在此次研究過程中，LIMK1在結腸癌中的表達水平顯著高于健康組織。LIMK1的表達與結腸癌患者的年齡大小、分化程度無關，與腫瘤的大小、淋巴結是否轉移以及TNM分期有關，是結腸癌發生和發展中的關鍵物質基礎，極有可能是結腸癌侵襲和轉移的重要生物標志和治療靶點，值得我們進一步深入研究。

[1] 梁賢文,王勝忠,彭 勃,等.腹腔鏡下橫結腸癌根治術36例臨床分析〔J〕.實用癌癥雜志,2012,27(2):206-207.

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[3] 馬艷華,蘇 波,向姝霖,等.二烯丙基二硫下調LIMK1抑制人胃癌MGC803細胞遷移與侵襲〔J〕.中國藥理學通報,2012,28(12):1714-1718.

[4] 顏鴻飛,蘇 堅,廖前進,等.LIMK1在結腸癌組織中表達的臨床病理意義〔J〕.腫瘤防治研究,2013,40(6):576-579.

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[6] 曾志涌.缺氧預處理新生大鼠缺氧缺血腦組織中Limk1蛋白表達〔J〕.廣州醫學院學報,2011,39(2):10-12.

[7] 周自華,陳尚忠,廖海球,等.MACC1基因在結腸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志,2012,27(1):30-31,40.

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[9] Chhavi，Saxena M，Singh S，et al.Expression profiling of G2/M phase regulatory proteins in normal，premalignant and malignant uterine cervix and their correlation with survival of patients〔J〕.J Cancer Res Ther,2010，6(2)：167-171.