NF-κB及Rb蛋白在進展期胃癌中的表達及E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中再表達的臨床意義

張宇龍 張國栓 崔專義 王桂琦

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移是其主要致死原因，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預后的重要因素。上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)可介導同種親和性的細胞間的黏附，其功能需要與其配體-連接素(catenin)結(jié)合成復合體才能起作用[1]，其表達異常與人類惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及腫瘤病人的預后密切相關(guān)[2]。NF-κB可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控許多基因的表達，可調(diào)控細胞凋亡、增殖的相關(guān)基因。視網(wǎng)膜母細胞基因(Rb基因)是人體1種重要的腫瘤抑制基因，同時Rb蛋白又受多種因子在多種層次上的調(diào)控，使其功能與細胞生長、分化相適應[3]。本實驗應用SP(生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)免疫組化法檢測了NF-κB、Rb及E-cadherin/catenin復合物在進展期胃癌及其相應轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達狀況，探討其與進展期胃癌臨床病理因素、其相互之間及其與患者預后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2005年3月-2008年6月在石家莊市第一醫(yī)院外科手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學檢查證實的進展期胃癌標本86例，男性70例，年齡30～79 歲，平均59.8歲；女性16例，年齡42 ～72 歲，平均年齡 59.2歲。其中71例獲得隨訪。病理類型：黏液腺癌21例、管狀腺癌57例、印戒細胞癌4例和腺鱗癌2例、未分化癌1例，鱗癌1例。其中高分化14例，中分化21例，低分化51例；侵及漿膜層78例，未侵及漿膜8例。入選病例均未接受過化療或放療，無長期服用非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)激素藥物史。

1.2 試劑

兔抗人多克隆NF-κB、α及β-catenin抗體購于NeoMarkers公司，鼠抗人單克隆E-cadherin抗體購于ZYMED公司，鼠抗人單克隆γ-catenin及兔抗人多克隆Rb抗體購于Santa Cruz公司，SP法試劑盒購于北京中杉公司。

1.3 方法

標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。采用免疫組織化學SP法，試劑盒使用按說明書進行操作。切片常規(guī)脫蠟入水，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復，5%羊血清處理20 min，滴加NF-κB一抗4 ℃過夜,DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯氨)顯色，蘇木精復染；PBS代替一抗作為陰性對照，以每張切片上相對正常的黏膜作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

E-cadherin/catenin復合物只有明顯胞膜染色的細胞被判定為正常染色；如染色不連續(xù)，明顯減弱或者缺失，或者出現(xiàn)胞質(zhì)染色，則被評定為不正常染色。每張切片按照全部癌細胞中的正常染色細胞的百分率評定為三級：1級為0～50%；2級為51% ～ 80%；3級為81% ～100%[4]。對于原發(fā)灶，如被評定為3級，則被認為是E-cadherin/catenin復合物的正常表達，而1級和2級染色則被認為是E-cadherin/catenin復合物的不正常表達；對于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)為3級而原發(fā)灶為1級或2級，或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)為2級而其原發(fā)灶為1級，則被評定為E-cadherin/catenin復合物再表達陽性；否則為再表達陰性。

NF-κB顯色陽性部位為胞質(zhì)或胞核，陽性細胞百分數(shù)≤5%為0分，6% ～ 25%為1分，26% ～ 50%為2分，≥51%為3分；基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將兩項積分相乘為最后得分，0 ～ 1分為陰性,≥2分為陽性。

Rb染色陽性信號為棕黃色，定位于細胞核和細胞質(zhì)，背景清晰，間質(zhì)無著色。每張切片由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測計數(shù)200個腫瘤細胞，依據(jù)鏡下陽性染色細胞占癌細胞總數(shù)的比例判定：陰性(-)：無棕黃色染色或陽性細胞數(shù)<10%；弱陽性(+)：陽性細胞數(shù)在10% ～25%；陽性(++)：陽性細胞數(shù)在25% ～50%；強陽性(+++)：陽性細胞數(shù)>50%。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，對所得數(shù)據(jù)采用χ2檢驗以及需要校正的χ2檢驗分析差異，應用Sperman秩相關(guān)分析各指標表達的相關(guān)性，采用Wilcoxon’s log-rank test 對生存曲線進行組間差別檢驗，應用Cox’s proportional-hazard對影響生存率的變量進行多變量分析。檢驗標準α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 各指標在胃癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達情況

NF-κB蛋白在86例進展期胃癌組織中表達陽性率達81.40%，Rb蛋白在86例進展期胃癌組織中表達陽性率達65.12%。E-cadherin/catenin復合物在原發(fā)灶中只有1例正常表達，85例異常表達，異常表達率為98.84%，該復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中再表達陽性率為63.95%(表1)。

2.2 NF-κB、Rb蛋白表達及E-cadherin/catenin復合物再表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

表1 NF-κB、Rb蛋白表達及E-cadherin/catenin復合物再表達(例，%)

NF-κB表達與胃癌病理類型(印戒細胞癌、未分化癌、磷癌及腺磷癌因樣本含量過小，故未予統(tǒng)計)密切相關(guān)(P<0.05)；NF-κB表達與腫瘤細胞分化程度密切相關(guān)(P<0.05)；NF-κB表達與腫瘤大小及腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。Rb蛋白表達與腫瘤細胞分化程度密切相關(guān)(P<0.05)；Rb蛋白表達與胃癌病理類型、腫瘤大小及腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中再表達與腫瘤細胞分化程度密切相關(guān)(P<0.05)；與胃癌病理類型、腫瘤大小及腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 NF-κB、Rb蛋白表達及E-cadherin/catenin復合物再表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系/例

2.3 NF-κB、Rb蛋白表達及E-cadherin/catenin復合物再表達與患者預后的關(guān)系

Kaplan-Meier曲線顯示NF-κB、Rb蛋白表達與患者預后無關(guān)，NF-κB表達陽性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(32，43)，中位生存時間為26個月，表達陰性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(20，33)，中位生存時間為27個月，表達陽性與陰性比較無顯著性差異(P>0.05)，Rb蛋白表達陽性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(29，41)，中位生存時間為25個月，表達陰性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(28，44)，中位生存時間為30個月，表達陽性與陰性比較無顯著性差異(P>0.05)；E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)再表達情況與患者的預后密切相關(guān)，E-cadherin/catenin復合物再表達陽性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(26，35)，中位生存時間為25個月，表達陰性生存均數(shù)的95%可信區(qū)間為(37，61)，中位生存時間為43個月，表達陽性與陰性比較差異顯著(P<0.05)。應用Wilcoxon’s log-rank test對生存曲線進行組間差別檢驗，發(fā)現(xiàn)差別無顯著統(tǒng)計學意義。

通過多變量分析發(fā)現(xiàn)，E-cadherin/catenin復合物及β-catenin在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)再表達可以作為獨立的預后因素(P<0.05 )(表3)。

表3 NF-κB、Rb蛋白表達及E-cadherin/catenin復合物再表達的多變量分析

2.4 NF-κB、Rb蛋白表達與E-cadherin/catenin復合物再表達的相關(guān)性

Sperman秩相關(guān)分析顯示NF-κB、Rb蛋白表達與E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中再表達均無顯著相關(guān)性。

3 討論

NF-κB是1種多向性的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細胞凋亡、增殖的相關(guān)基因，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控許多基因的表達。近來的研究傾向于NF-κB可拮抗細胞凋亡，并在晚G1期抑制細胞周期的進程[5]。其表達已經(jīng)成為診斷白血病、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的腫瘤的一項指標[6]。關(guān)于NF-κB在胃癌中的作用機制尚未明確，可能與NF-κB激活其下游基因C-myc的表達或在轉(zhuǎn)錄水平激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)[7]有關(guān)，已知C-myc蛋白表達異常增加可誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤形成，有研究顯示小鼠C-myc基因啟動子上存在NF-κB的作用位點，并能在一定條件下被后者轉(zhuǎn)錄激活[8]。本研究顯示，NF-κB蛋白在進展期胃癌中存在高表達，表明NF-κB蛋白的表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切關(guān)系。另有報道NF-κB蛋白與E-cadherin/catenin復合物中的β-catenin在胃癌腫瘤原發(fā)灶中的表達存在協(xié)同作用，但是本研究顯示NF-κB蛋白與包括β-catenin在內(nèi)的E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中的再表達無相關(guān)關(guān)系，本研究結(jié)果顯示NF-κB蛋白的表達與患者預后生存率無關(guān)。

Rb基因是經(jīng)典的抗癌基因，Rb基因在正常情況下對細胞分裂起著重要的抑制作用，這種抑制作用的減弱將導致細胞發(fā)生異常增殖，最終發(fā)生癌變，不典型增生與胃癌中Rb蛋白表達率明顯低于正常胃癌粘膜，提示Rb蛋白表達缺失與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。有實驗證實，不是所有的Rb突變均可見測到Rb蛋白的缺失，相反可導致一種無功能的Rb蛋白，即突變型的Rb蛋白表達[9]。而有學者證實野生型Rb蛋白有抑制細胞增殖的功能，突變型Rb蛋白則失去抑制作用[10]。本研究顯示，Rb蛋白在進展期胃癌原發(fā)灶中存在相對的高表達，Rb蛋白的表達與胃癌腫瘤細胞的分化程度密切相關(guān)，這與Rb基因做為一個經(jīng)典的抑癌基因的作用是相符的。有學者認為Rb基因產(chǎn)物表達可作為輔助臨床判斷胃癌預后的生物學指標，但本研究顯示Rb蛋白的表達與患者的預后生存率無顯著關(guān)系，可能是由于生成了突變型Rb蛋白的影響。

細胞黏附功能的喪失不僅參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而且使細胞間信息的交流受阻，腫瘤細胞喪失接觸性生長抑制，可能在上皮細胞早期惡性轉(zhuǎn)化、無限增殖、失去分化中起到重要作用[11-12]。而E-cadherin/catenin復合物與腫瘤的關(guān)系尤為引人注目。Jawhari等[13]研究發(fā)現(xiàn)異型增生胃粘膜E-cadherin異常表達高達21%，可能是發(fā)生在E-cadherin基因水平上的異常，是發(fā)展成惡性較高、浸潤生長的分子學基礎(chǔ)。在一些有關(guān)進展期胃癌和食道癌的報道中，α-catenin的表達與腫瘤臨床病理形態(tài)的關(guān)系更加密切。BukholmIK等已經(jīng)注意到乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶內(nèi)癌組織β-catenin再表達的情況[14]，Brabletz等[15]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中存在β-catenin異常表達，β-catenin異常表達者生存時間與正常表達著有顯著差異，與生存期密切相關(guān)，是獨立的胃癌生存期預測因子。Jawhari等[13]研究發(fā)現(xiàn)，異常增生胃粘膜組織γ-catenin28%異常表達，γ-catenin異常染色體在浸潤型胃癌100%，同時與腫瘤分期、分化明顯相關(guān)。目前絕大多數(shù)的研究都是關(guān)于腫瘤原發(fā)灶的，很少涉及轉(zhuǎn)移灶。劉津等[16]研究發(fā)現(xiàn)相當一部分胃癌細胞在原發(fā)灶內(nèi)E-cadherin/catenin復合體表達異?；蛘呷笔?，導致細胞間粘附功能下降，癌細胞脫落轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的胃癌細胞則會重新出現(xiàn)該復合體的陽性表達，促使轉(zhuǎn)移癌細胞間粘附功能增強，促使其形成有效的轉(zhuǎn)移灶。本研究顯示，E-cadherin/catenin復合物在胃癌原發(fā)灶的正常表達極低，僅有1例完全正常表達，其余均有不同程度的表達異?；蛉笔?，而其中有55例出現(xiàn)了該復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中再表達陽性，表明該復合物在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移后發(fā)生聚集形成有效轉(zhuǎn)移灶的過程中可能發(fā)揮著重要作用。E-cadherin/catenin復合物在高、中分化胃癌的再表達陽性率顯著高于低分化腫瘤，表明高分化腫瘤更容易出現(xiàn)再表達陽性，解釋了臨床實際出現(xiàn)的高分化胃癌患者的生存率并不高于低分化胃癌患者這一現(xiàn)象，表明該復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中再表達情況發(fā)揮了重要作用。本研究顯示E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中再表達情況與患者的預后密切相關(guān)，可以作為一個獨立的預測預后的因子，其中β-catenin的再表達情況也與患者的預后密切相關(guān)，這與劉津等[16]報道的研究結(jié)果相一致。

He等[17]發(fā)現(xiàn)C-mgc基因是β-Cat-Tcf/lef復合物的靶基因。AntonNoraks等研究表明CD1也是β-catenin的靶基因。Alberts[18]發(fā)現(xiàn)，C-mgc基因是NF-κB系統(tǒng)的靶基因， NF-κB通過上調(diào)C-mgc基因轉(zhuǎn)承活性，而調(diào)節(jié)C-mgc的表達。另外，細胞周期素(CD1)是1種作用于G1期的細胞周期相關(guān)蛋白，促進G1/G0期進入S期，Guttridge等研究證實，NF-κB可啟動CD1的轉(zhuǎn)錄促進細胞增殖[19]。Rb對細胞增殖分化的調(diào)控與多種cyclins、CDKs、TGF-β2的參與有關(guān)?？梢钥闯鯪F-κB、Rb蛋白與E-cadherin/catenin復合物在分子水平上有共同的作用基因，而且有報道說NF-κB蛋白與β-catenin在胃癌原發(fā)灶協(xié)同表達[20]。

綜上所述，三者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后等方面可能存在著某種聯(lián)系。可能是NF-κB在胞質(zhì)中受到各種理化、生物等刺激與特異性抑制物解離激活而進入胞核，在分子水平影響多基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞癌變； Rb基因產(chǎn)物的磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化，不能繼續(xù)阻止細胞由G1到S期的演進，促進細胞癌變；在以上兩者發(fā)生作用的同時，E-cadherin/catenin復合物在癌變細胞的表達及其功能發(fā)生異?；蛘呷笔В辜毎g粘附作用減弱的同時促進了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，而該復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中發(fā)生的再表達陽性情況有效的促進了轉(zhuǎn)移癌細胞的聚集，影響了的預后。這可能是有關(guān)于胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后的一個完整過程，然而其機理仍需進一步證實。本研究顯示NF-κB、Rb蛋白在腫瘤原發(fā)灶的表達與E-cadherin/catenin復合物在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中再表達三者間無相關(guān)性，提示三者間的作用機制仍需進一步研究。

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