早期胃癌中淋巴結微轉移及LMO4、DLEC1表達的臨床意義

陳曉軍 劉勝春

隨著醫療水平的提高，早期胃癌的診斷率日益增高，手術是其最有效的治療手段，但術后仍有部分患者會復發，主要是由淋巴結微轉移所致。LMO4、DLEC1已被認為在消化道惡性腫瘤的轉移過程中起重要作用,但LMO4、DLEC1與早期胃癌淋巴結微轉移之間關系的臨床意義尚未清楚。本研究通過免疫組化方法前瞻性研究50例早期胃癌患者淋巴結微轉移與原發灶LMO4、DLEC1的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究中50例早期胃癌組織標本取自我院普外科2007年6月-2010年2月手術標本,其中男性31例,女性19例;年齡37～71歲,平均55.6歲；按組織學分類:高分化20例，中分化13例，低分化14例，印戒細胞3例；按腫瘤部位分類：胃體8例，胃竇42例；按侵犯深度分類：黏膜層11例，黏膜肌層17例，黏膜下層22例；按淋巴結轉移分類：有淋巴結轉移3例，無淋巴結轉移47例。納入標準：本組資料全部組織標本獲取前未經放療和化療，有詳細的臨床資料，所有患者均行標準的胃癌D2根治術。

1.2 主要試劑

LMO4和DLEC1兔抗人多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，SP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自武漢博士德生物工程有限公司。亞甲藍購自美國Gibco公司，細胞角蛋白(cytokeratin,CK)單抗鼠抗CK-20蛋白購自美國Cell signaling公司。

1.3 免疫組織化學染色

1.3.1 淋巴結免疫染色 全組50例早期胃癌患者術后標本共采集到1 225枚淋巴結,平均每例24.5枚，分別進行常規HE染色和CK免疫組化染色，以標準SAB免疫組織化學染色法進行CK染色，腫瘤及淋巴結標本用10%甲醛固定和石蠟包埋，石蠟切片脫蠟、水化、3%過氧化氫、EDTA溶液修復抗原后、山羊血清封閉后,滴加CK抗體(1∶500工作濃度)，沖洗并滴加辣根過氧化酶標記的二抗,并以DAB顯色,以亞甲藍進行背景染色,以PBS作為陰性對照。

1.3.2 LMO4和DLEC1免疫組化檢測 采用免疫組化 SP 法，并用 DAB 顯色。所有標本均采用高溫高壓修復抗原，并按照試劑說明書進行染色。用已知的陽性切片作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 染色結果判定

所有結果由兩位有經驗的病理醫師對染色切片進行診斷，CK染色表現為黃棕色顆粒，只在CK染色中發現,但HE染色未能診斷的淋巴結轉移稱為微轉移。

LMO4蛋白陽性染色表現為細胞核呈棕黃色或者棕褐色。根據視野中染色的細胞所占百分比評估染色的強度，分為3個等級：55%以下表示輕度及以下染色，>55%～70%為中度染色，>70%為強度染色。定義染色等級<55%的是低表達，≥55%即認為是高表達。

DLEC1蛋白陽性染色表現為細胞質呈棕黃色或者棕褐色，根據視野中染色的細胞所占百分比評估染色的強度，分為4個等級：0～5%為-，≥6%～25%為+，≥26%～50%為++，>50%為+++。“-，+”為低表達，“++，+++”為高表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。采用χ2檢驗、確切概率法及Spearman等級相關分析法。用Kaplan-Meier法繪制5年生存曲線,P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 早期胃癌淋巴結轉移情況

50例早期胃癌患者中,HE 染色發現的淋巴結轉移2例，而 CK 免疫組化染色發現的淋巴結轉移12例,兩種方法淋巴結轉移率差異比較有統計學意義(χ2=6.597,P<0.05)；在全部1 225枚淋巴結中,淋巴結受累率HE染色發現的為7枚，而CK免疫組化染色發現的淋巴結受累率為25枚,兩種方法淋巴結轉移率差異比較有統計學意義(χ2=33.793，P<0.05)。

2.2 早期胃癌臨床病理因素與淋巴結微轉移的關系

在50例早期胃癌中黏膜內癌的淋巴結轉移率為9.1%(1/11)，黏膜肌層癌的淋巴結轉移率為11.8%(2/17)，黏膜下癌的淋巴結轉移率為40.9%(9/22)，淋巴結微轉移與侵犯深度有顯著相關性(P<0.05)；高分化癌發現的淋巴結轉移率為5.0%(1/20)，中分化癌發現的淋巴結轉移率為15.4 %(2/13)，低分化癌發現的淋巴結轉移率為57.1 %(8/14)，印戒細胞癌發現的淋巴結轉移率為33.3%(1/3)，淋巴結微轉移與侵犯程度有顯著相關性(P<0.05)，但與腫瘤直徑、腫瘤部位無相關性。見表1。

表1 早期胃癌臨床病理資料及淋巴結微轉移的關系(例，%)

2.3 LMO4、DLEC1在早期胃癌中的表達

早期胃癌組織中LMO4表達與浸潤深度、淋巴結微轉移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯正相關(P<0.05)，DLEC1表達與浸潤深度、淋巴結微轉移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯負相關(P<0.05)。兩者表達均與患者的年齡、性別無關(P>0.05)。見表2。

表2 早期胃癌組織中LMO4、DLEC1表達/例

注：*為與高表達組相比較，P<0.05。

2.4 LMO4、DLEC1在早期胃癌組織中表達的關系

在早期胃癌組織中LMO4與DLEC1蛋白表達經Spearman等級相關性分析，結果顯示,LMO4與DLEC1蛋白存在負相關(γ=-0.788,P=0.001)。見表3。

表3 在早期胃癌組織中LMO4、DLEC1的關系/例

2.5 早期胃癌患者的預后

早期胃癌患者5 年生存率為96.0%，平均時間35.2個月(28～60個月)。按早期胃癌患者的淋巴結微轉移分為微淋巴結轉移組和無微淋巴結轉移組。根據生存分析法分析微淋巴結轉移的無瘤中位生存時間為32.5個月，無微淋巴結轉移的無瘤中位生存時間為38.8個月，兩者無瘤生存率的差異無統計學意義(P=0.068)。

3 討論

每年全球新發胃癌100余萬例，死亡約80萬例，中國占35%，發病率和死亡率均是世界平均水平的兩倍多。轉錄調節因子LMO4、DLEC1與胃癌的發生發展及患者的預后是否存在相關性，其病因、發病機制和浸潤轉移的信號傳導機制等仍尚未明確。如何有效地阻止腫瘤的發生轉移及改善患者預后生活質量已成為現今學者研究的方向。人類基因組編碼4個 LMO (lim domain only)蛋白，分別是 LMO1-LMO4，LMO4 作為轉錄調節因子亞家族 LMO中的一員是最后被發現的，其在細胞分化決定、組織形成、器官發育中起到了重要作用[1-4]。EMT是胚胎發育過程中出現轉分化的基礎，同時也是腫瘤細胞演進與遷移的基礎，而LMO4的表達也集中在EMT活躍的區域，其可能參與了EMT中信號通路的調節，在腫瘤發生過程中發揮重要作用[5-6]。已有不少研究[7-12]發現在人類多種腫瘤中DLEC1均有異常表達，且體外實驗也顯示其可以抑制細胞聚集和生長，誘導細胞周期阻滯，在細胞生長過程中發揮負性調節作用[13]。劉艷華等[8-9]實驗結果顯示，DLEC1在肺癌中表達下調，且其表達與組織學類型、淋巴結轉移等相關，提示DLEC1基因的失活與NSCLC的發生發展可能具有相關性。葉曉兵等[10]用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP) 檢測DLEC1基因在結直腸癌患者組織和血清中的甲基化狀態，發現在CRC 組織和血清DNA 中，DLEC1 基因啟動子甲基化比例均高于對照組，且組織和血清DNA中具有良好的一致性。數據顯示，在CRC 患者中DLEC1 基因有著較高的檢出率。至今尚未有關于LMO4、DLEC1與早期胃癌淋巴結微轉移方面的文獻，因此本研究通過免疫組織化學檢測LMO4、DLEC1在早期胃癌中的表達情況。

經免疫組化染色，LMO4 蛋白細胞核呈棕黃色或者棕褐色，DLEC1 蛋白的細胞漿呈棕黃色或者棕褐色。實驗結果顯示，在50例早期胃癌中黏膜內癌、黏膜肌層癌、黏膜下癌的淋巴結轉移率分別為9.1%、11.8%、40.9%；且高分化癌、中分化癌、低分化癌、印戒細胞癌淋巴結轉移率分別為5.0%、15.4%、57.1%、33.3%，證實了淋巴結微轉移與侵犯深度，與組織學類型有顯著相關性。腫瘤浸潤深度越深，惡性程度越高，淋巴結內轉移的癌細胞數量可能就越多，提示淋巴管受侵犯情況與淋巴結微轉移具有相關性[14]。早期胃癌組織中LMO4、DLEC1的表達與患者的年齡、性別均無關。LMO4與臨床病理因素如浸潤深度、淋巴結微轉移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯正相關，證實在早期胃癌中LMO4在有淋巴結微轉移的病例中高表達，即 LMO4在有淋巴結微轉移組中高表達，提示可能其參與了胃癌的轉移侵襲。而DLEC1與浸潤深度、淋巴結微轉移、組織分化程度、腫瘤大小有較強的負相關性(P<0.05)，在淋巴結微轉移組的表達明顯低于無淋巴結微轉移組，提示DLEC1對臨床預后判斷具有重要意義。經Spearman等級相關性分析，LMO4 和 DLEC1 兩者之間存在相關關系，呈負性相關。通過生存分析發現，早期胃癌患者的5年生存率為96.0%。分析結果顯示，無微淋巴結轉移的無瘤中位生存時間為38.8個月，高于微淋巴結轉移組。說明淋巴結微轉移可能造成淋巴結內以聚集形式出現癌細胞轉移，進而向更遠的淋巴結轉移，影響患者的生存率。

綜上所述， LMO4 及 DLEC1 基因與胃癌的發病機制和浸潤轉移有一定的相關性。聯合檢測兩基因可能對胃癌的早期診斷及預后監測具有重要意義。

[1] 劉艷華,熊小亮.DLEC1基因的研究現狀與進展〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2010，26(5):606-608.

[2] Kwong RA,Scarlett CJ,Kalish LH， et al.LMO4 expression in squamous cell carcinoma of the anterior tongue〔J〕.Histopathology,2011,58(3):477-480.

[3] Monta ez-Wiscovich ME,Shelton MD,Seachrist DD,et al.Aberrant expression of LMO4 induces centrosome amplification and mitotic spindle abnormalities in breast cancer cells〔J〕.J Pathol,2010,222(3):271-281.

[4] Murphy NC,Scarlett CJ,Kench JG,et al.Expression ofLMO4 and outcome in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Br J Cancer,2008,98(3):537-541.

[5] 李靜怡，申秀錦，鄧 紅.LM04調節腫瘤發生過程中的上皮-間質轉化〔J〕.浙江大學學報(醫學版)，2011,40(1):107-111.

[6] Lu Z,Lam KS,Wang N，et al.LM04 can interact with Smad proteins and modulate transforming growth factor-B signaling in epithelial cells〔J〕.Oncogene，2006，25(20)：2920-2930.

[7] Seng TJ， Currey N， Cooper WA， et al. DLEC1 and MLH1 promoter methylation are associated with poor prognosis in non-small cell lung carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2008，99(2)：375-382.

[8] 劉艷華， 羅達亞， 艾有生，等.非小細胞肺癌中DLEC1與Ki-67的表達及意義〔J〕.廣東醫學，2010,31(12)：1585-1587.

[9] 劉艷華， 羅達亞， 艾有生，等.非小細胞肺癌中DLEC1的表達缺失與臨床病理因素的相關研究〔J〕.實用醫學雜志，2010,26(16)：2898-2901.

[10] 葉曉兵，張有為，陳龍邦.DLEC1 基因在結直腸癌中的甲基化水平及臨床意義〔J〕.第二軍醫大學學報，2010，31(8)：842-845.

[11] Fujimura T,Tsukada T,Kinoshita J,et al.Lymph node micrometastases in gastric cancer〔J〕.Nihon Geka Gakkai Zasshi，2013,114(1):13-16.

[12] Arigami T,Uenosono Y,Yanagita S,et al.Clinical significance of lymph node micrometastasis in gastric cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2013,20(2):515-521.

[13] Yano K,Nimura H,Mitsumori N,et al.The efficiency of micrometastasis by sentinel node navigation surgery using indocyanine green and infrared ray laparoscopy system for gastric cancer〔J〕.Gastric Cancer，2012,15(3):287-291.

[14] 陳煥年，王榮朝，王 勍.早期胃癌前哨淋巴結微轉移臨床分析〔J〕.江蘇醫藥，2011,37(1)：77-79.