Smad4及P21WAF1/CIP1在卵巢上皮癌組織中的表達及意義

陳鳳云 胡小青

TGF-β/Smads信號通路中的信號由細胞核外進入核內要借助于Smads家族中的核心成員Smad4的核轉運功能。若Smad4突變或缺失，整個TGF-β超家族信號轉導網絡就會被破壞，胞外信號無法轉運入核，使得下游基因的轉錄調節不受控制，導致增殖與分化失衡，形成腫瘤。有研究證實P21WAF1/CIP1是TGF-β/Smads信號通路的下游靶基因，P21WAF1/CIP1啟動子的轉錄活性受Smad4的調控，當Smad4羧基末端被截斷后，P21WAF1/CIP1的表達嚴重下降[1-2]。多數研究者認為TGF-β/Smads信號通路對于正常卵巢上皮的生長調控是至關重要的，若此信號通路及其下游靶基因遭到破壞時則可能導致卵巢癌的發生[3-6]。我們以卵巢上皮腫瘤組織中Smad4上游信號正常為假設前提,探討Smad4蛋白及其下游信號在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性轉化過程中的作用及相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月-2009年12月江西省婦幼保健院收治的行手術切除的89例卵巢組織標本存檔蠟塊，患者術前均未行任何治療，均有完整的臨床病理資料，均經病理檢查確診，并由兩位主治級別以上的病理醫師復查HE切片核實病理診斷。卵巢上皮癌按FIGO2000分期標準進行分期。

卵巢上皮良性腫瘤組24例：漿液性囊腺瘤14例，黏液性囊腺瘤10例,年齡19～54歲。卵巢上皮交界性腫瘤組22例：漿液性交界瘤8例，黏液性交界瘤14例,年齡23～58歲。

卵巢上皮癌組43例，均為原發癌，年齡30～68歲，中位年齡50歲。病理類型：漿液性囊腺癌18例，黏液性囊腺癌10例，子宮內膜樣癌15例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期20例。組織學分化：高分化(G1)9例，中低分化(G2-3)34例。有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移31例。

1.2 主要試劑及方法

Smad4(SC-7966)為濃縮型單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司(由北京中杉金橋公司代購)；P21WAF1/CIP1(ZM-0206)為即用型單克隆抗體,P21WAF1/CIP1抗體及SP試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

采用S-P兩步法進行免疫組織化學染色，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3 判斷標準

Smad4蛋白表達主要定位于細胞質,也有少量位于細胞核中;P21WAF1/CIP1蛋白表達主要定位于細胞核;以細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞。選擇染色均勻的腫瘤區域,在 400 倍視野下計數著色細胞占細胞總數的百分比,共計數 10個視野,取平均值。① 按著色細胞占視野細胞總數的比例分為 0～3級：無陽性細胞為0 級；< 25 %為1級;25%～50 %為2級;>50 %為3級。② 按染色強弱分:0 級，陰性;1級，弱;2級，中;3 級，強。按 ①與②級數之和判斷結果，以0～6表示：0～2 為(-);3～4為(+);5～6為(++)。(-)和(+)為陰性組,(++)為陽性組。

1.4 統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。計數資料采用卡方檢驗，小樣本資料采用Fisher確切概率法。相關性應用非參數統計中的Spearman等級相關性分析。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 Smad4在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(表1)

表1 Smad4蛋白在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(例，%)

卵巢上皮良性腫瘤與卵巢上皮交界性腫瘤組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05；卵巢上皮交界性腫瘤與卵巢上皮癌組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05；卵巢上皮癌與卵巢上皮良性腫瘤組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05。

2.2 Smad4蛋白表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系(表2)

Smad4蛋白表達與卵巢上皮癌的FIGO分期、組織學類型，病理分化及淋巴結有無轉移無相關性。

表2 Smad4蛋白表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

2.3 P21WAF1/CIP1在卵巢組織中的表達

P21WAF1/CIP1在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達見表3。

表3 P21WAF1/CIP1蛋白在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(例，%)

卵巢上皮良性腫瘤與卵巢上皮交界性腫瘤組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05；卵巢上皮交界性腫瘤與卵巢上皮癌組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05；卵巢上皮癌與卵巢上皮良性腫瘤組織Smad4陽性表達率比較，P>0.05。

2.4 P21WAF1/CIP1蛋白表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系(表4)

P21WAF1/CIP1蛋白表達與卵巢上皮癌的FIGO分期及病理分化密切相關，與其組織學類型及有無淋巴結轉移無相關性，見表4。

表4 P21WAF1/CIP1蛋白表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關系

2.5 卵巢上皮癌組織中Smad4及P21WAF1/CIP1蛋白表達的相關性

43例卵巢上皮癌組織中,Smad4及P21WAF1/CIP1同時呈陽性表達13例；同時呈陰性表達6例；22例Smad4呈陽性表達而P21WAF1/CIP1呈陰性表達；有2例Smad4呈陰性表達而P21WAF1/CIP1呈陽性表達。經統計，Smad4及P21WAF1/CIP1蛋白在卵巢上皮癌組織中的表達無相關性(Rs=0.099,P>0.05)。

3 討論

Smad4,又稱DPC4(Deleted in pancreatic cancer 4)，位于染色體18q21.1上，是研究胰腺癌時發現大多數標本的18號染色體長臂上存在雜合性缺失(loss of heterozygosity LOH)，予命名為DPC4(Deletedin Pancreatic Cancer4)基因。后來發現DPC4蛋白與果蠅的MAD和線蟲的Sma2、Sma3、Sma4蛋白屬同源蛋白，都是轉化生長因子(TGF-β)超家族信號傳導的成員，參與細胞內信號傳導，所以后來將這類蛋白統稱為Smads蛋白，故DPC4也稱為Smad4。Smad4作為Smad家族的核心成員，既是TGF-β超家族受體的直接底物，又是將受體信號傳遞導核內的遞質。若Smad4突變或缺失，整個TGF-β超家族信號轉導網絡就會被破壞，胞外信號無法轉運入核，使得下游基因的轉錄調節不受控制，導致增殖與分化失衡，最終形成腫瘤。有報道Smad4在其腦膠質瘤、大腸癌、肝癌、宮頸癌等多種腫瘤中都有不同程度表達下調[7-10]。Heini等[11]通過等位基因分析后認為，18q21.1近端區域的Smad4、Smad2、DDC為卵巢癌抑癌基因，三者中一個或一個以上的等位基因突變或缺失在卵巢上皮癌的形成事件中占有相當大的作用。本試驗在前人研究的基礎上，假定卵巢上皮腫瘤組織中TGF-β受體正常的前提下，對89例卵巢腫瘤組織進行Smad4蛋白檢測后發現Smad4的缺失并不是卵巢上皮癌發生發展的關鍵原因。

P21CIP1是尋找細胞周期依賴性蛋白激酶調節蛋白時發現的1種可與其相互作用的蛋白，與野生型P53蛋白激活因子為同一基因，又稱為P21WAF1/CIP1基因，是P53重要的下游基因。當細胞受到各種損傷后，野生型P53通過P21WAF1/CIP1上游2.4kb和8kb處的P53蛋白特異性結合位點結合并表達產生P21WAF1/CIP1蛋白，這是依賴P53途徑的功能。P21還有非依賴P53途徑的功能，即P53通路破壞時，P21WAF1/CIP1蛋白可以在TGF-β/Smads通路中的信號刺激而高表達[12]；這是因為在其第二個外顯子的近端區域(-124/-61)間含有多個構成性轉錄協同因子SP1結合位點，它能與結合在Smad2/3/4的MH1區域上的SP1結合，而誘導P21WAF1/CIP1蛋白的表達。本研究與Annette等研究相符[13]，這些數據表明在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性轉化的過程中，P21WAF1/CIP1蛋白的陽性表達率逐漸下降；在卵巢上皮癌組織中，病理分化越低、臨床分期越晚，P21WAF1/CIP1蛋白陽性表達率越低；提示P21WAF1/CIP1蛋白的缺失與卵巢上皮腫瘤的惡性進展關系密切。

多數研究者認為，在胰腺癌、肝癌及乳腺癌等惡性腫瘤中P21WAF1/CIP1為Smad4的下游靶基因，其表達水平受Smad4蛋白的調控，并與Smad4的表達水平呈正相關；若上游的Smad4蛋白表達下降，P21WAF1/CIP1的表達水平也相應下降，其抑制細胞周期的活性也隨著降低，使DNA復制失控，最終導致細胞癌變的發生。但是在我們的研究中發現：在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性進展的過程中，Smad4蛋白表達無明顯改變，而P21WAF1/CIP1蛋白的表達則有一個下降的過程。這表明Smad4蛋白的缺失可能并不是卵巢上皮腫瘤惡性進展的關鍵原因;且卵巢上皮惡性腫瘤組織中P21WAF1/CIP1蛋白的表達并不受Smad4蛋白表達的調控。總之，TGF-β所介導的TGF-β/Smads信號通路在卵巢上皮癌中不能正常發揮生長抑制作用，不是因為Smad4蛋白的核轉運功能障礙，可能是由于Smad4蛋白的上游信號異常所致。在下一步的研究工作中，我們將對卵巢上皮癌組織中Smad4蛋白的上游信號再行研究，以探討此信號通路中其它組成成分在卵巢上皮癌發生發展過程中的作用。

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