蛇床子素骨靶向藥物對體外培養大鼠成骨細胞護骨素、核因子-κB受體活化因子配基表達的影響

馬 勇 郭 楊 袁 濤 魯俊山 劉尚侖 黃國淳

(南京中醫藥大學骨傷研究所，江蘇 南京 210023)

蛇床子素是中藥蛇床子的主要成分，具有刺激成骨細胞增殖，增強骨代謝活動,促進骨修復和骨重建以及抗骨質疏松等作用〔1，2〕。近年研究〔3，4〕發現成骨細胞分泌的RANKL能與破骨細胞及其前體上的核因子-κB受體活化因子配基(RANK)結合，促進成熟的破骨細胞形成。成骨細胞分泌的護骨素(OPG)可以與RANKL結合，競爭抑制RANKL與RANK之間的結合，有效抑制骨轉換和破骨過程的活躍〔5〕。本文研究不同濃度的蛇床子素骨靶向藥物(NSC-OST)對體外培養的成骨細胞OPG、RANKL表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新生24 h內SD大鼠10只，性別、體重不限，由南京醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2008-0004。

1.2主要儀器與試劑 低糖DMEM培養基、胎牛血清(Hyclone 公司)；NSC-OST(中國藥科大學新藥研究中心提供)；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、雙抗(Gibco公司)；大鼠OPG酶聯免疫試劑盒、大鼠RANKL酶聯免疫試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司)；超凈工作臺(蘇州華宇凈化設備有限公司)；酶標儀(BioTeK 美國)；倒置式系統相差顯微鏡(Olympus 日本)。

1.3成骨細胞的分離、培養及純化 新生24 h的SD乳大鼠雙蒸水沖洗數次后夾頸處死，75%酒精中浸泡15 min；迅速取出頭蓋骨，并快速剔除附著的結締組織及骨膜，無血清培養液沖洗3次至頭蓋骨呈白色，用眼科剪將其剪成約1 mm×1 mm大小的骨片；將碎骨片放入預先置有5 ml 0.25%胰蛋白酶的培養皿內，37℃條件下恒溫消化20 min，棄去消化液，以清除纖維組織；然后將碎骨片加入預先置有5 ml 0.1%Ⅱ型膠原酶的培養皿內，37℃振蕩器振蕩，50次/min,60 min，消化2次，將2次收集的上清以1 000 r/min離心10 min，去上清；加入含15% FBS的低糖DMEM培養基制成單細胞懸液，調節細胞密度至106/ml，將細胞懸液接種于25 cm2培養瓶中培養。置于5% CO2、37℃培養箱中培養2 h后，吸出培養瓶內培養液移至第二瓶培養瓶中，培養10 min后，再同樣接種到第三瓶培養瓶中，以達到純化OB的目的。24 h后換液，除去未貼壁的細胞，每3天更換培養液1次，第2代的細胞即可用于實驗。

1.4藥物分組 取生長狀態良好的第2代成骨細胞制成細胞懸液，以終濃度為1×105/ml接種于24孔培養板，并隨機分為五組，對照組為不含NSC-OST的正常培養基，實驗組為含NSC-OST的終濃度依次為10-7、10-6、10-5、10-4mmol/L組。24 h后成骨細胞貼壁，更換無血清培養液，待細胞周期同步化后，各組分別加入不同濃度NSC-OST進行培養，每2天更換培養液1次。

1.5成骨細胞OPG、RANKL表達檢測 生長狀態良好的第2代成骨細胞按上述方法培養7 d，取細胞上清，根據大鼠OPG ELISA試劑盒和大鼠RANKL ELISA試劑盒說明書進行檢測：每組依次加入100 μl相應的樣本，再將100 μl檢測抗體加到每個孔中，空白孔除外，酶標板上加上覆膜，在37℃下孵育4 h，棄孔內液體，每孔用300 μl沖洗液沖洗3次，最后一次沖洗后，倒置在吸水紙上拍干多余水分；加100 μl的酶結合物到每個孔中，并用塑料膜蓋上，在37℃下孵育1 h，每孔沖洗5次并拍干，再在每孔中加入100 μl底物液，室溫下避光孵育30 min；加50 μl終止液到每個孔中，輕輕搖勻；在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，用酶標儀在450 nm波長測量每個孔的OD值。

2 結 果

2.1不同濃度NSC-OST對大鼠成骨細胞OPG、RANKL表達的影響 10-6、10-5mmol/L組對成骨細胞OPG的表達均有不同程度的促進作用，明顯高于空白對照組(P<0.01)，且10-5mmol/L組促進OPG表達作用明顯高于10-6mmol/L組(P<0.01)；10-7、10-6、10-5mmol/L組抑制成骨細胞分泌RANKL的作用高于空白對照組(P<0.05)，而10-6、10-5mmol/L兩組間差異無統計學意義(P=0.35)。提示終濃度為10-6、10-5mmol/L組的NSC-OST具有促進成骨細胞OPG的表達和抑制其分泌RANKL的作用，且兩組間抑制成骨細胞分泌RANKL的作用無明顯差異，而10-5mmol/L組促進OPG表達的作用最為明顯。見表1。

表1 不同濃度NSC-OST對大鼠成骨細胞OPG、RANKL表達的影響±s，n=8)

2.2不同濃度NSC-OST對大鼠成骨細胞OPG/RANKL比值的影響 10-6mmol/L、10-5mmol/L組可上調成骨細胞OPG/RANKL比值(2.04±0.13，2.35±0.29)，且明顯高于空白對照組(1.54±0.11，P<0.01)；10-5mmol/L組上調OPG/RANKL比值效果優于10-6mmol/L組(P=0.02)。10-4、10-7mmol/L組的NSC-OST上調成骨細胞OPG/RANKL比值不明顯(1.42±0.22，1.68±0.14，P>0.05)。

3 討 論

人體骨組織處于不斷重建過程之中，正常成人體內的骨礦沉積與骨吸收處于平衡狀態，在病理狀態下，骨形成的周期較骨吸收的周期長，新骨的形成相對舊骨的吸收不足，從而導致骨丟失〔6〕，產生各種骨疾病，近年來從分子生物學角度研究發現，RANK/RANKL/OPG系統與骨性疾病密切相關，是所有骨性疾病最為相關的治療靶點〔7〕。因此研究RANK/RANKL/OPG系統在骨重建中的作用已成為防治骨疾病的熱點。

RANKL是一種跨膜蛋白，主要由成骨細胞和激活的T細胞表達，是目前發現的參與破骨細胞調控的最重要的因子之一。RANKL可通過與破骨細胞表面的受體RANK結合，誘導前體破骨細胞分化成熟、增強破骨細胞運動能力并抑制破骨細胞的凋亡而間接促進其骨吸收功能〔8〕。本研究提示終濃度為10-6、10-5mmol/L NSC-OST可以抑制成骨細胞分泌RANKL。

OPG是由成骨細胞分泌的一種糖蛋白，可作為RANKL的天然阻滯受體，它通過與RANKL結合，競爭性地抑制RANKL與RANK的結合，而RANK是OC表面介導RANKL生物活性的唯一受體，所以可以特異性地抑制OC的增殖分化，降低其骨吸收功能，從而起到保護骨與關節的作用〔9〕。本實驗說明10-6mmol/L和10-5mmol/L濃度的NSC-OST都能促進成骨細胞OPG的表達，且10-5mmol/L組效果最明顯。

研究發現，RANK/RANKL/OPG系統是破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路，是成骨細胞作用于破骨細胞的重要途徑〔10〕，王艷等〔11〕研究發現蛇床子素可顯著上調OPG mRNA表達水平，但對RANKL mRNA表達無影響，但最終可通過影響OPG/RANKL比值來抑制破骨細胞的骨吸收作用。可見，成骨細胞所表達的OPG和RANKL水平，尤其是OPG/RANKL比值，決定了其對分化破骨細胞的調控方向〔12〕。本研究顯示，10-6、10-5mmol/L組的NSC-OST可上調成骨細胞OPG/RANKL比值，且10-5mmol/L組作用最為明顯。

綜上，蛇床子素骨靶向藥物防治骨質疏松的機制可能是一方面直接抑制RANKL的分泌，降低破骨細胞的活性；另一方面促進成骨細胞分泌OPG，競爭性地阻斷了一部分RANKL與RANK的結合，抑制了破骨細胞活化、成熟，達到抑制了骨吸收的目的。

4 參考文獻

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