阿爾茨海默病患者血漿淀粉樣變水平對血液物理指數(shù)的影響

蘭 杰 薛 蓉 李春芳 宋敬敬 李曉亮 盧 鑫 孫續(xù)國

(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津 300203)

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆的一種常見類型，主要病理學(xué)特征為大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞內(nèi)外有神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑塊形成，并伴神經(jīng)突觸的丟失以及大腦實質(zhì)萎縮〔1〕。大量研究發(fā)現(xiàn)有多種因素可導(dǎo)致AD患者腦組織血流低灌注〔2～7〕，其中體循環(huán)血液流體異常也會導(dǎo)致AD患者腦組織血流低灌注，如全血黏度增加、紅細胞變形能力減弱、紅細胞聚集性增加等多種血液流變因素均可導(dǎo)致腦組織血流低灌注〔8～10〕。但是AD患者血液淀粉樣變狀態(tài)以及血淀粉樣變對于血液流體的影響缺少系統(tǒng)研究。先前本組已建立血液淀粉樣變的測定方法〔11〕，本文進一步系統(tǒng)分析AD患者血漿淀粉樣變水平，并探討淀粉樣變與血液物理指數(shù)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料 AD組:來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治患者30 例，男24 例，女6 例，平均年齡(69.40±8.57)歲，均符合NINCDS-ADRDA中的AD診斷標準。健康對照組:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院健康檢查者30例，男26例，女4例，平均年齡(65±4.4)歲，AD 組與對照組年齡無顯著差異(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 血液流變學(xué)檢測 采集清晨空腹靜脈肝素抗凝血8 ml(肝素抗凝采血管，上海卒瑞生物科技有限公司)，4 h內(nèi)完成實驗。采用LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式黏度儀，實驗室測定溫度27℃，同批血漿淀粉樣變測定血液物理指數(shù)。

1.2.2 測定血漿淀粉樣變6 mol/L ThT溶液與血漿進行反應(yīng)，20 min，采用FL F-2500熒光分光光度計檢測熒光強度，計算淀粉樣纖維水平。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡分析(WB)4%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍溶液對蛋白進行染色。免疫印跡實驗，鼠抗 A單克隆抗體(Abcam，Cambridge，UK)孵育 60 min，10 mmol/L PBS(pH 7.4)緩沖液洗滌，酶標記二抗體(Abcam，Cambridge，UK)孵育60 min，CE成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，計量資料以s表示，組間比較采用獨立資料t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié)果

2.1 比較AD患者與對照組血漿淀粉樣變水平 利用淀粉樣變特異性熒光探針，測定兩組血漿中淀粉樣變熒光強度，結(jié)果AD患者明顯高于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色結(jié)合WB分析血漿Aβ蛋白分布 SPS-PAGE及WB分析結(jié)果顯示大小分子比例未見明顯差別，AD患者與對照組均可與Aβ發(fā)生免疫反應(yīng)，分子量170～15 kD，分布與蛋白染色未見明顯不同。見圖1。

表1 比較AD患者與對照組之間血漿淀粉樣變熒光強度及血液物理指數(shù)差異(s，n=30)

表1 比較AD患者與對照組之間血漿淀粉樣變熒光強度及血液物理指數(shù)差異(s，n=30)

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2.3 淀粉樣變熒光強度與血液物理指數(shù)之間的相關(guān)性 AD患者全血黏度低切(1.00、5.00、3.00 s-1)值(r=0.674，P=0.032;r=0.677，P=0.031;r=0.674，P=0.033)、全血黏度的均值(200S-1，r=0.677，P=0.031)、全血高切相對指數(shù)(r=0.737，P=0.015)、全血低切相對指數(shù)(r=0.715，P=0.020)與血淀粉樣變水平呈正相關(guān)，而血細胞比容、紅細胞剛性指數(shù)、紅細胞變形指數(shù)TK均未見有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 血漿蛋白SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍蛋白染色和抗人Aβ抗體Western印跡結(jié)果及CE蛋白豐度掃描分析

3 討論

大量報道ThT能夠與淀粉樣變纖維結(jié)合，其熒光強度能夠反映淀粉樣變水平，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于測定淀粉樣變纖維含量〔12，13〕。本文結(jié)果提示AD患者血漿淀粉樣變水平增高。提示淀粉樣變對于血液流體影響主要體現(xiàn)在血漿部分。

眾所周知，AD患者淀粉樣變前蛋白為Aβprotein，觀察免疫反應(yīng)能夠體現(xiàn)淀粉樣變伴隨成分。AD患者和對照組均可見Aβprotein分布于血漿的大分子與小分子結(jié)合，提示與血漿蛋白結(jié)合，實驗結(jié)果支持淀粉樣變影響血液黏度。

綜上，AD患者血漿淀粉樣變水平明顯增高，淀粉樣變與血漿成分結(jié)合，改變?nèi)黧w指數(shù)，對于紅細胞變形及聚集性未見明顯差別，可作為AD患者調(diào)節(jié)血液流體狀態(tài)的參考指標。

1 Honjo K，Black SE，Verhoeff NPLG.Alzheimer＇s disease，cerebrovascular disease，and the β-amyloid cascade〔J〕.Canadian J Neurol Sci，2012;39:712-28.

2 Ishii K，Ito K，Nakanishi A，et al.Computer-assisted system for diagnosing degenerative dementia using cerebral blood flow SPECT and 3DSSP:a multicenter study〔J〕.Jap J Radiol，2014;31(1):1-8.

3 Akiyama HS，Barger S，Barnum B，et al.Inflammation and Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2000;21(3):383-421.

4 Berzin TM，Zipser BD，Rafii MS，et al.Agrin and microvascular damage in Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2000;21(2):349-55.

5 Buee L，Hof PR，Delacourte A.Brain microvascular changes in Alzheimer＇s disease and other dementias〔J〕.Ann N Y Acad.Sci，1997;826(1):7-24.

6 Grammas P，Ovase R.Inflammatory factors are elevated in brain microvessels in Alzheimer＇s disease〔J〕.Neurobiol，2001;22(6):837-42.

7 Thirumangalakudi L，Samany PG，Owoso A，et al.Angiogenic proteins are expressed by brain blood vessels in Alzheimer＇s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2006;10:111-8.

8 Ajmani RS，Metter EJ，Jaykumar R，et al.Hemodynamic changes during aging associated with cerebral blood flow and impaired cognitive function〔J〕.Neurobiol.Aging，2000;21:257-69.

9 Chen SM，F(xiàn)an CC，Chiue MS，et al.Hemodynamic and neuropathological analysis in rats with aluminum trichloride-induced Alzheimer＇s disease〔J〕.PLoS One，2013;8(12):e82561.

10 Chang CY，Liang HJ，Chow SY，et al.Hemorheological mechanisms in Alzheimer＇s disease〔J〕.Microcirculation，2007;14(6):627-34.

11 Sun X，Ando Y，Haraoka K，et al.Role of VLDL/chylomicron in amyloid formation in familial amyloidotic polyneuropathy〔J〕.Biochem Biophy Res Comm，2003;311(2):344-50.

12 Groenning M.Binding mode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloid fibrils＇current status〔J〕.J Chem Biol，2009;3(1):1-18.

13 Alí-Torres J，Rimola A，Rodríguez-Rodríguez C，et al.Insights on the binding of thioflavin derivative markers to amyloid-like fibril models from quantum chemical Calculations〔J〕.J Phys Chem B，2013;117(22):6674-80.