人IFN-γ基因啟動(dòng)子的克隆鑒定及功能分析

湯必奎 程 禹 翟素蓮 劉小粉 胡明潔 吳守偉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系，安徽 蚌埠 233030)

IFN-γ是由機(jī)體內(nèi)活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，具有抗感染、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細(xì)胞、提高M(jìn)HCⅠ類和Ⅱ類分子的表達(dá)、促進(jìn)抗原提呈等，在機(jī)體抗感染與免疫中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。現(xiàn)有研究認(rèn)為其主要通過JAK-STAT、PI3K等途徑激活〔4，5〕，但近期有報(bào)道提示IFN-γ激活和其調(diào)控區(qū)域的DNA甲基化修飾相關(guān)，如在Th1/Th2細(xì)胞分化過程中的IFN-γ表達(dá)和調(diào)控區(qū)域甲基化狀態(tài)相關(guān)〔6〕。DNA甲基化調(diào)控主要和基因啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)，高甲基化狀態(tài)時(shí)基因沉默，而低甲基化狀態(tài)時(shí)基因激活，所以為研究IFN-γ表達(dá)的表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制，本研究中首先克隆了啟動(dòng)子區(qū)域并進(jìn)行功能分析和甲基化狀態(tài)的鑒定，為后繼研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞E.coliDH5菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏；pGL3-basic和pRL質(zhì)粒購自Promega公司；人胚腎來源細(xì)胞系HEK293T培養(yǎng)基為DMEM含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 μg/L鏈霉素，培養(yǎng)于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2試劑 分子克隆所有試劑購自Takara公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Axygen公司；無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒小抽試劑盒購自Qiagen公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000購自Invitrogen公司；熒光素酶檢測試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司；ploy I:C dsRNA購自Sigma公司；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Sss Ⅰ購自NEB公司；DNA合成和測序由Invitrogen公司完成；其他分析純?cè)噭┵徸陨虾幱邢薰尽?/p>

1.3方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 人IFN-γ基因序列(No：NC_000012.11)從美國國立生物技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)獲得；啟動(dòng)子預(yù)測及轉(zhuǎn)錄因子分析利用在線數(shù)據(jù)庫Promoter 2.0 Prediction Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)和TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)完成；甲基化分析利用MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)完成。

1.3.2引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(Invitrogen公司合成)，IFNγ-F：5′-CGACGCGTTTTCTACTGGGCAGTGCTGA-3′，IFNγ-R：5′-CCGCTCGAGCGTTTCCGAGAGAATTAAGC-3′。以人類來源的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán)30次。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.3.3熒光素酶載體的構(gòu)建 擴(kuò)增得到的700 bp產(chǎn)物凝膠電泳純化回收后，用限制性內(nèi)切酶MIuⅠ和XhoⅠ雙酶切，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。pGL3-Basic 質(zhì)粒用MIuⅠ和XhoⅠ雙酶切后使用膠回收試劑盒回收純化。分別酶切純化的擴(kuò)增片段和質(zhì)粒片段用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α細(xì)胞，先菌液PCR初步篩選陽性克隆，再通過雙酶切和測序驗(yàn)證，即得到含有IFN-γ潛在啟動(dòng)子區(qū)域的luciferase報(bào)告載體，命名為pIFNγ。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染和啟動(dòng)子活性的檢測 HEK293T細(xì)胞按2×105鋪板于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待生長至密度為70%～80%時(shí)，用pIFNγ報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)參照海腎熒光素酶(Renilla)報(bào)告載體pRL共轉(zhuǎn)染，24 h后換為不完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h按照Dual-Luciferase Reporter Assay System用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光素酶的活性。每個(gè)樣本進(jìn)行3～4個(gè)平行孔實(shí)驗(yàn)，啟動(dòng)子活性以螢火蟲熒光素酶(Luciferase)催化反應(yīng)底物產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度讀值與內(nèi)參照海腎熒光素酶(Renilla)催化產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度讀值的比值來表示，即相對(duì)熒光強(qiáng)度(RLA)。

1.3.5體外甲基化分析 1 μg的pIFNγ報(bào)告質(zhì)粒用Sss Ⅰ于37 ℃處理30 min后，PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，再用此質(zhì)粒和pRL共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，檢測啟動(dòng)子活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.5 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得IFN-γ基因序列(NC_000012.11)，截取從翻譯起始點(diǎn)ATG后30 bp開始至上游5 000 bp的區(qū)域(即68556371-68553371)進(jìn)行分析。首先用Promoter 2.0進(jìn)行分析，提示前700 bp區(qū)域得分最高，再用TFSEARCH Search分析該區(qū)域存在大量轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)，所以我們初步將該區(qū)域確定在翻譯起始點(diǎn)ATG前-1～-688區(qū)域，具體序列見圖1A。同時(shí)，對(duì)該區(qū)域做了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析，顯示存在大量結(jié)合位點(diǎn)，以及該區(qū)域存在大量的可能甲基化CG位點(diǎn)，如圖1B所示。

2.2pIFNγ載體構(gòu)建 以正常成人外周血來源基因組為模板，IFNγ-F和IFNγ-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見成功擴(kuò)增出IFN-γ基因啟動(dòng)子片段，與預(yù)計(jì)片段大小一致為700 bp左右(圖2A)。將目的片段和pGL3載體連接轉(zhuǎn)化后菌落PCR鑒定，可見有陽性克隆(圖2B)，克隆提取質(zhì)粒后MluⅠ和XhoⅠ雙酶切可見700 bp插入目的片段(圖2C)。將這兩個(gè)克隆進(jìn)行測序，結(jié)果和NCBI參考序列一致，說明含IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域的luciferase報(bào)告載體構(gòu)建成功。

A：選定的啟動(dòng)子區(qū)域，下劃線C為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，下劃線ATG為翻譯起始點(diǎn)；B：該區(qū)域的甲基化位點(diǎn)分析

2.3pIFNγ載體活性分析 為驗(yàn)證構(gòu)建的pIFNγ載體是否有活性，將pIFNγ或pGL3空載體和內(nèi)參照載體pRL共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后檢測相對(duì)熒光強(qiáng)度。pIFNγ可以顯著啟動(dòng)luciferase活性(22.4±3.1)，而pGL3載體(1.1±0.2)和不轉(zhuǎn)染的空細(xì)胞(0.2±0.1)不能啟動(dòng)luciferase活性，說明插入的IFN-γ啟動(dòng)子片段具有活性。同時(shí)，已知IFN-γ可被dsRNA誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步檢測pIFNγ是否能被dsRNA polyIC激活，polyIC可顯著增強(qiáng)IFN-γ啟動(dòng)子活性(81.7±2.4)，是加PBS的mock對(duì)照(25.5±3.9)的3倍左右，進(jìn)一步說明pIFNγ構(gòu)建的成功。

2.4DNA甲基化影響pIFNγ活性 從前面的生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)克隆的IFNγ啟動(dòng)子區(qū)域有潛在的甲基化位點(diǎn)，而甲基化是和基因表的的沉默相關(guān)。據(jù)此，本研究分析了pIFNγ載體甲基化后對(duì)IFNγ啟動(dòng)子活性的影響，當(dāng)使用體外甲基化酶SSSI處理后，啟動(dòng)子活性下降達(dá)5倍(42.2±3.4 vs 8.9±1.3)，這和理論推斷一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了pIFNγ載體的功能。

A：PCR擴(kuò)增目的片段，泳道1為擴(kuò)增產(chǎn)物；B：菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化克隆，泳道1～8為待鑒定菌落；C：雙酶切鑒定菌落PCR陽性克隆，泳道1,2分別代表B中的5和7菌株；M：DL2000 DNA Marker

3 討 論

病毒感染被宿主免疫識(shí)別后啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其中IFN-γ是一個(gè)非常重要的抗病毒因子，其機(jī)制是通過JAK-STAT等途徑激活，但新近的研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ的表達(dá)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制相關(guān)。表觀遺傳學(xué)是一類不涉及遺傳物質(zhì)改變的基因調(diào)節(jié)方式，發(fā)現(xiàn)其幾乎存在于生物調(diào)控的所有環(huán)節(jié)，在發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中都扮演著重要的作用，其中一個(gè)重要機(jī)制是DNA甲基化，高甲基化狀態(tài)和基因沉默相關(guān)，而低甲基化則和基因激活相關(guān)〔7，8〕。本研究結(jié)果提示其具有啟動(dòng)活性，在激活劑dsRNA刺激下，活性顯著上調(diào)，說明克隆的區(qū)域具有啟動(dòng)子活性。同時(shí)為了驗(yàn)證啟動(dòng)子活性是否和DNA甲基化相關(guān)，用SssⅠ體外甲基化后發(fā)現(xiàn)其活性顯著下降，進(jìn)一步驗(yàn)證克隆的區(qū)域具有活性。

4 參考文獻(xiàn)

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