缺血修飾性白蛋白指數結合FTIR技術評估早期糖尿病腎病的氧化應激損傷

孫 華 郭玉珊 翟羽佳 鄭 娜

(北華大學第一臨床醫學院附屬醫院內分泌科，吉林 吉林 132001)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者最主要的并發癥及死因，并已成為終末期腎病的最主要原因。大量研究提示DN的發生、進展與氧化應激密切相關。目前，常用活性氧簇(ROS)產物評估氧化應激，近年來，不斷有新的技術、指標用于氧化應激評估，本研究應用紫外光譜相關的缺血修飾性白蛋白(IMA)指數以及傅里葉變換紅外光譜相關的A1650/A1550對單純糖尿病(SDM)患者、糖尿病合并早期腎病(EDN)患者、健康對照者的血清進行氧化應激水平檢測，以分析該指標對DM及EDN氧化應激損傷的評估價值，從而為EDN診斷及治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1對象 收集我院2012年1月至2013年3月入院治療的2型糖尿病(T2DM)患者106例(診斷標準參照WHO/IDF《糖尿病及其引起的高血糖的定義和診斷》2006年版)〔1〕，根據24 h尿微量白蛋白排泄率(UMAER)將患者分為SDM組49例(UMAER<20 μg/min)、EDN組57例(20 μg/min≤UMAER≤200 μg/min)，健康志愿者(對照組)32例(經體檢確定)，所有受試者排除冠心病、缺血性動脈疾病、高血壓、肝臟疾病、血清白蛋白水平異常(<3.5 g/dl或>5.5 g/dl)、原發性腎病及血液透析。 SDM組、EDN組與對照組年齡、性別基本匹配。SDM組與EDN組年限差異無統計學意義(P>0.05)。EDN組的收縮壓高于對照組，而舒張壓與對照組的差異無統計學意義(P>0.05)；EDN組與SDM、SDM組與對照組比較，收縮壓及舒張壓差異均無統計學意義(P>0.05)。SDM組、EDN組的WHR均顯著高于對照組，但糖尿病兩個亞組之間比較差異無統計學意義。見表1。

1.2基本情況 采集受試者的年齡、性別、患DM年限、收縮壓、舒張壓、腰圍(W，肋骨下緣與髂嵴連線中點水平周徑)、臀圍(H，臀部最大周徑)等基本信息，計算局部體脂，以腰臀比(WHR)報告。

表1 各組資料對比情況±s)

1.3生化指標 應用全自動生化分析儀(Roche，瑞士)及原裝配套試劑檢測血清肌酐、空腹血糖、糖化血紅蛋白、肌酸激酶(CK)同工酶(CK-MB)及血清白蛋白。應用自動免疫比濁法檢測尿微量白蛋白。應用ELISA試劑盒(Cell Biolabs，美國)檢測血8-羥化脫氧烏苷(8-OHdG)水平。應用白蛋白-鈷結合(ACB)試驗相關試劑(Ischemia Technology)檢測IMA〔2〕。

1.4ATR-FTIR檢測及光譜分析 應用Nicolet iN10傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher，美國)，MCT檢測器，iZ10 micro-ATR附件及匹配OMNIC 8.0軟件包。參數選擇透射模式，分辨率為4/cm，掃描次數為64次，以去離子水為掃描背景。應用OMNIC讀取光譜，進行自動基線校正、自動平滑、ATR校正，ZnSe晶體，底角45°。讀取1 650/cm及1 550/cm附近吸收峰的峰面積，以A1 650/A1 550報告。

2 結 果

2.1生化指標 本研究檢測的血清肌酐、CK-MB及血清白蛋白僅用于樣本篩選，不進行統計學分析。SDM組及EDN組的空腹血糖分別為(7.21±1.31)、(7.96±1.15)mmol/L，差異無統計學意義；兩組的糖化血紅蛋白分別為(7.4±1.1)%、(7.5±1.2)%，差異無統計學意義；對照組、SDM組及EDN組的8-OHdG分別為13.0±3.9、21.2+5.0、29.4±7.5，SDM組與對照組、EDN組比較差異有統計學意義(P<0.05)，對照組與EDN組比較差異有統計學意義(P<0.01)；對照組、SDM組及EDN組的IMA指數分別為78.1±9.8、96.7±11.1、108.8±9.8，其中SDM組及EDN組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，SDM組與EDN組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2紅外光譜 對照組、SDM組及EDN組平均紅外光譜顯示范圍為1 710～1 480/cm。對照組、SDM組及EDN組的A1 650/A1 550對比，其中SDM組與對照組、EDN組比較差異顯著(P<0.05)，對照組與EDN組比較差異顯著(P<0.01)。

3 討 論

DN是DM全身性微血管病變表現之一，臨床特征為蛋白尿、漸進性腎臟損害、高血壓、水腫，晚期可出現嚴重腎衰。英國遠期DM研究組指出嚴格控制血糖可以降低T2DM患者合并DN的風險〔3〕，但我國DM患者的血糖控制普遍不理想，T2DM患者合并DN的患病率高達38.8%〔4〕。高血糖引起腎臟血流動力學變化以及葡萄糖代謝異常引起的級聯損傷是造成腎臟病變的基礎，而生長因子、細胞因子的活化是DN形成的直接機制，在上述諸多發病機制中，目前認為氧化應激是重要的共同機制〔5〕。因此，有效地對DM患者進行氧化應激評估，不僅有利于EDN的及時診斷，而且有利于系統評價患者的氧化應激損傷或提供治療的新靶點。

ROS產物水平是評估氧化應激的常用指標，考慮到蛋白質廣泛存在于細胞內外，極易受ROS攻擊發生氧化修飾或出現蛋白羰基，在氧化應激早期即可形成，且具有較好的穩定性，因此可通過測定相關生物標志物作為氧化應激評估，例如IMA。Roy等〔6〕認為IMA升高可以有效反映機體氧化應激水平，Lee等〔2〕證實IMA指數可以有效校正個體蛋白差異對檢測的影響。本實驗結果從一定程度上印證了DM患者合并腎病的根本機制是由于機體的氧化應激損傷，該指標對于診斷EDN意義重大。

根據Moganson分類，認為出現微量蛋白尿是診斷DN的標準，但近年來UMEA的出現是否代表腎臟損害、是否必然出現DN進展屢現爭議。由于UMEA并不能完全作為診斷DN的指標，大量研究尋找其他可以預測或評估腎臟損害的臨床及實驗室指標。p16蛋白(一種皮膚成纖維細胞中與細胞周期調節相關的調節蛋白)雖然可以用于預測DN發生，但方法過于繁瑣，難以推廣〔7〕。因此，尋找檢測便捷、行之有效的生物指標，對于EDN的診斷尤為重要。傅里葉變換紅外光譜技術的發展始于上世紀80年代，該技術具有快速、準確、無損地對生物樣本進行分子水平測定的特點。結合ATR附件后，可以有效糾正、消除水對于光譜的影響，更適用于血清等液體樣本的檢測。ATR-FTIR可以系統地分析脂質、核酸以及蛋白質的結構及含量，而且可以有效地分析蛋白質二級結構，從而評估組織或細胞的氧化應激水平〔8〕。本研究結果顯示A1 650/A1 550，可以有效地反映SDM患者及EDN患者機體不同的氧化應激水平，同時該方法兼具檢測便捷的優點，單個樣本掃描時間僅為數十秒，且無需對樣本進行處理。

4 參考文獻

1World Health Organization. Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia-report of a WHO/IDF consultation〔M〕. Geneva：WHO Press,2006：13-6.

2Lee YW，Kim HJ，Cho YH，etal. Application of albumin-adjusted ischemia modified albumin index as an early screening marker for acute coronary syndrome〔J〕. Clin Chim Acta， 2007；384(1-2)：24-7.

3UK Prospective Diabetes Study Group. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes(UKPDS 33)〔J〕. Lancet，1998；352(9131)：837-53.

4Kung k，Chow KM，Hui EM，etal. Prevalence of complications among Chinese diabetic patients in urban primary care clinics：a cross-sectional study〔J〕. BMC Fam Pract，2014；15(1)：8.

5Tavafi M. Diabetic nephropathy and antioxidants〔J〕. J Nephropathol，2013；2(1)：20-7.

6Roy D，Kaski JC. Ischemia-modified albumin：the importance of oxidative stress〔J〕. J Am Coll Cardiol,2007；49(24)：2375-6.

7Zeng L，Kanwar YS，Amro N，etal. Epigenetic and genetic analysis of p16 in dermal fibroblasts from type 1 diabetic patients with nephropathy〔J〕. Kidney Int，2003；63(6)：2094-102.

8Palaniappan PR，Vijayasundaram V. Fourier transform infrared study of protein secondary structural changes in the muscle of Labeo rohita due to arsenic in toxication〔J〕. Food Chem Toxicol，2008；46(11)：3534-9.