沐舒坦預處理對大鼠急性肺損傷的肺保護作用研究

徐忠能，薛濤

(東南大學附屬中大醫院 胸外科，江蘇 南京 210009)

臨床上誤吸為最常見的直接肺損傷原因之一，而一旦胃內容物誤吸并發展為急性肺損傷(ALI/ARDS)死亡率高達40%～60%[1- 2]，因此，如何進行肺保護一直是臨床研究的重要課題。沐舒坦(Ambroxol)是一種具有多種生物學活性的黏液溶解劑。Park[3]、Pfeifer[4]、Gillissen[5]等研究發現，大劑量沐舒坦可以通過抗炎、抗氧化及促進肺泡表面活性物質生成等方式起到肺保護作用。近些年國內相關臨床研究[6]也證實，大劑量沐舒坦具有一定的肺保護作用。然而關于沐舒坦的劑量選擇上仍未形成統一標準。本研究擬通過觀察不同劑量的沐舒坦預處理對鹽酸吸入致大鼠急性肺損傷模型的肺保護作用，為臨床沐舒坦應用劑量選擇提供一定的理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級成年雄性SD大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)40只，體重170～220 g。

1.1.2 試劑 沐舒坦由上海勃林格殷格翰藥業有限公司提供，TNF- α、IL- 10試劑盒由南京凱基生物科技發展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 將40只健康清潔成年的SD大鼠隨機分成5組，每組8只：生理鹽水組(吸入生理鹽水)、稀鹽酸組(吸入稀鹽酸)、稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(10 mg·kg-1·d-1)、稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(20 mg·kg-1·d-1)]、稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量處理組[吸入稀鹽酸+沐舒坦(40 mg·kg-1·d-1)]。稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組分別予相應劑量沐舒坦尾靜脈注射，生理鹽水及稀鹽酸兩組予等體積的生理鹽水行尾靜脈注射，每天1次，連續3 d，期間大鼠自由接觸食物和水。第3天尾靜脈注射沐舒坦或生理鹽水30 min后各組大鼠再腹腔注射10%水合氯醛3 ml·kg-1麻醉，待肢痛反射消失后參照Nader等[7]的方法并略作改進制作鹽酸吸入性肺損傷模型。將大鼠固定于操作臺，呈頭高位60°，頸部備皮消毒，沿頸部中線剪開皮膚，分離各層組織至暴露氣管。用1 ml注射器針頭經暴露的環甲膜處插入，生理鹽水組大鼠氣管內注射生理鹽水(1.2 ml·kg-1)，稀鹽酸組，稀鹽酸+沐舒坦低、中、高劑量處理組大鼠氣管內滴注稀鹽酸(1.2 ml·kg-1，pH=1.2)。注完藥物后仍保持此體位3 min，拔出注射器，用1號絲線逐層縫合傷口，局部消毒后將大鼠固定帶松開置于觀察箱中觀察。讓大鼠自主呼吸空氣，并允許大鼠自由接觸水和食物。

1.2.2 指標測定 生理鹽水或稀鹽酸吸入后觀察6 h，期間無大鼠死亡。6 h后存活大鼠予10%水合氯醛3 ml·kg-1腹腔注射麻醉，待肢痛反射消失后將大鼠仰臥位固定于實驗臺上，快速開胸，于心尖處抽取動脈血，分成兩份血標本，一份迅速行動脈血氣分析，另一份低溫下離心(3 000 r·min-1)10 min，吸取上清，-80 ℃保存，留待后期統一應用放射免疫方法測量血清中TNF- α、IL- 10含量。抽血后立即取出完整肺臟，右肺稱濕重后置于80 ℃烘箱中，48 h后稱干重，計算W/D。左肺置4%甲醛中固定，石蠟包埋，病理切片HE染色后行普通光學顯微鏡檢查。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 肺組織病理變化

2.1.1 大體觀察 生理鹽水組呈均勻的粉白色，表面光滑，無出血灶，彈性好；稀鹽酸組呈暗紅色，可見明顯充血水腫及散在出血點；稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組也可見局部充血水腫和滲液，但較稀鹽酸組損傷范圍及損傷程度明顯減輕，且隨著沐舒坦劑量遞增，肺損傷表現越輕。

2.1.2 光鏡觀察 生理鹽水組肺組織結構完整，肺泡壁結構清晰，肺泡壁及間質內無水腫、炎癥細胞浸潤等特殊改變。稀鹽酸組肺泡壁破壞嚴重，大量肺泡萎陷，肺泡、肺間質水腫明顯，肺泡間隔增寬，組織中可見點狀出血及炎癥細胞浸潤等改變。稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組肺泡及間質水腫較稀鹽酸組有所減輕，仍可見部分肺泡萎陷、炎癥細胞浸潤及點狀出血改變。稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量兩組病理改變較輕，組織稍疏松，毛細血管輕度擴張充血，間質輕度水腫。見圖1～5。

圖1生理鹽水組織病理變化HE×100

圖2稀鹽酸組肺組織病理變化HE×100

2.2 肺濕干重比(W/D)

W/D值生理鹽水組最低，稀鹽酸組最高，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量處理組介于生理鹽水和稀鹽酸組兩組之間，且隨著沐舒坦劑量遞增，W/D值遞減，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量處理組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，余組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)(表1)。

圖3Hcl+沐舒坦低劑量處理組肺組織病理變化HE×100

圖4Hcl+沐舒坦中劑量處理組肺組織病理變化HE×100

圖5Hcl+沐舒坦高劑量處理組肺組織病理變化HE×100

組 別n濕干比生理鹽水組84.28±0.18稀鹽酸組85.03±0.22a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組84.81±0.21ab稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組84.62±0.12abc稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組84.53±0.18abc

與生理鹽水組比較，aP<0.05；與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

2.3 血氣分析

生理鹽水組pH值在正常范圍，余4組pH皆低于7.35。稀鹽酸組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量與生理鹽水組比較，差異有統計學意義(均P<0.05)，稀鹽酸組,稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量4組之間比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。PaO2值生理鹽水組最高，稀鹽酸組最低，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組PaO2與沐舒坦劑量呈正相關，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間比較無顯著差異(P>0.05)，余組間比較均有顯著差異(均P<0.05)。稀鹽酸組PaCO2最高，與生理鹽水組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，生理鹽水組，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量4組之間比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

2.4 血清TNF- α、IL- 10 測定結果

血清TNF- α水平稀鹽酸組最高，生理鹽水組最低，稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組血清中TNF- α含量與沐舒坦劑量呈負相關，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。血清中IL- 10含量按生理鹽水組、稀鹽酸組、稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量組順序依次增高，稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

本實驗采用鹽酸吸入致大鼠急性肺損傷模型(按1.2 ml·kg-1吸入pH 1.2的稀鹽酸)。與吸入生理鹽水的對照組相比，吸入鹽酸組的大鼠明顯活力下降，呼吸急促，煩躁不安，紫紺；PaO2明顯降低，PaCO2、肺W/D、促炎性因子TNF- α明顯增高。光鏡下病理切片示肺泡壁破壞嚴重，大量肺泡萎陷，肺泡、肺間質水腫明顯，肺泡間隔增寬，組織中可見點狀出血及炎癥細胞浸潤等改變。說明采用1.2 ml·kg-1，pH 1.2的稀鹽酸吸入制作大鼠急性肺損傷模型成功。

組 別 npHPaO2PaCO2生理鹽水組87.36±0.0397.46±1.1634.35±1.73稀鹽酸組87.17±0.04a59.04±5.32a42.75±5.81a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組87.20±0.03a69.50±5.84ab38.38±3.12b稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組87.24±0.05a80.75±3.55abc36.81±2.25b稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組87.25±0.06a83.54±3.27abc35.35±3.51b

與生理鹽水組比較，aP<0.05；與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

組 別 nTNF-α/pg·m-1IL-10/pg·m-1生理鹽水組859.99±6.9212.38±0.93稀鹽酸組8178.32±16.29a21.48±1.51a稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組8125.79±13.54ab29.15±1.14ab稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組887.50±8.34abc34.70±2.20abc稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組880.28±9.19abc35.63±2.31abc

與生理鹽水組比較，aP<0.05，與稀鹽酸組比較，bP<0.05；與稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量組比較，cP<0.05

酸吸入性肺損傷的發生機制曾被認為主要是胃液內酸性物質和消化酶對肺組織的直接損傷。但近些年一些研究[8- 9]證實，局部損傷后的炎癥反應在肺損傷的發生發展中扮有更重要的角色。主要表現為肺巨噬細胞、毛細血管內皮細胞等炎癥細胞的激活，產生和釋放大量炎癥因子和生物介質，趨化大量中性粒細胞在肺臟聚集并被激活，產生活性氧自由基等，造成廣泛的嚴重的炎性損傷。TNF- α是急性肺損傷過程中最早產生的炎性介質之一[10]，其可激活損傷的中性粒細胞、內皮細胞進一步釋放氧自由基、溶酶體酶等介質，誘導組織細胞損傷，引起急性肺損傷。本實驗中，鹽酸吸入后，大鼠血清中TNF- α含量明顯升高(P<0.05)，說明了炎癥反應被啟動。

沐舒坦是一種具有多種生物學效應的黏液溶解劑，但近年來許多實驗證實，大劑量的沐舒坦具有一定的肺保護作用。主要表現在以下幾個方面：(1) 抗炎、抗氧化作用。沐舒坦可降低血液中活性氧水平，通過活化的中性粒細胞，降低超氧負離子、HCLO的水平，以抑制A1AT的鈍化，從而改善肺功能參數[11]。(2) 促進肺泡表面活性物質合成。(3) 松弛氣道平滑肌。(4) 對氣道壁離子轉運和電位差的影響。IL- 10是一種重要的抑炎因子，在肺內主要由單核巨噬細胞等合成和分泌。本實驗觀察了10、20、40 mg·kg-13種劑量的沐舒坦對肺的保護作用，結果顯示，沐舒坦治療組血清IL- 10水平較稀鹽酸組明顯升高，TNF- α水平明顯降低。而且血清IL- 10水平隨沐舒坦劑量遞增而增高，而TNF- α水平則降低。由此表明，3種不同劑量的沐舒坦都能明顯減輕肺部炎性反應，促進抗炎反應，減輕肺泡及間質水腫和肺組織出血等病理改變。同時血氣結果表明，沐舒坦還可明顯改善低PaO2狀況，降低PaCO2。但稀鹽酸吸入+沐舒坦低、中、高劑量3組組間比較發現，稀鹽酸吸入+沐舒坦低劑量與稀鹽酸吸入+沐舒坦中、高劑量組之間TNF-α和IL- 10水平差異有統計學意義(P<0.05)；稀鹽酸吸入+沐舒坦中劑量組與稀鹽酸吸入+沐舒坦高劑量組之間TNF- α和IL- 10水平差異無統計學意義(P>0.05)。表明在一定劑量范圍之內，沐舒坦對急性肺損傷保護作用與劑量呈正相關，但超過一定范圍時，這種正相關作用并不明顯。

大劑量沐舒坦的肺保護作用在臨床上已經引起廣泛重視，但在應用劑量的選擇上國內仍無統一標準[12]。目前國內研究主要集中于急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征和圍手術期肺保護方面。本實驗中僅采用酸吸入制作大鼠急性肺損傷模型來研究不同劑量沐舒坦的肺保護作用，由于實驗中控制因素太多，所以實驗結果并不能完全套用于臨床實際工作中。關于沐舒坦肺保護作用與劑量的相關性仍需大量的動物實驗及臨床應用情況來繼續探討。

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