IL- 6對小鼠腎上腺皮質細胞系Y1合成皮質醇的影響

文小平，夏海鳴

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 附屬第二醫院，江蘇 南京 210003)

目前認為，白介素6(interleukin- 6,IL- 6)與腎上腺皮質功能密切相關，它可以通過下丘腦- 垂體- 腎上腺(Hypothalamic- Pituitary- Adrenal，HPA)軸調節腎上腺皮質功能，也可直接作用于腎上腺來影響腎上腺皮質功能。此外，腎上腺自身可分泌IL- 6，通過自分泌或旁分泌方式參與腎上腺皮質功能的調節。但IL- 6對腎上腺皮質功能的具體影響及調節機制仍不明確。本研究旨在探討IL- 6單獨及聯合ACTH處理小鼠腎上腺皮質細胞后皮質醇合成水平的變化，以及皮質醇合成過程中類固醇急性調節蛋白(StAR)相關基因的調控作用，從而為今后深入了解內毒素休克過程中IL- 6對腎上腺皮質功能的影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎上腺皮質細胞系Y1(中科院上海細胞生物研究所)，IL- 6(Prospec公司)，ACTH(Sigma公司)，F12培養基(南京凱基生物科技發展有限公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，臺盼藍染液(南京生興生物科技有限公司)，皮質醇放免檢測試劑盒(原子高科股份有限公司)，Trizol(美國Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo Fisher)，TaqDNA Polymerase(美國Thermo Fisher)，Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(日本TOYOBO)，0.1% DEPC水(南京凱基生物科技發展有限公司)，引物由上海英俊公司合成。

1.2 細胞培養

小鼠腎上腺皮質細胞系Y1細胞用含10%的胎牛血清、1.176 g NaHCO3及100 U·L-1青鏈霉素的F12培養液，在體積分數為5%CO2、37 ℃濕飽和的條件下培養。細胞生長至80%融合時，以0.25%的混合胰酶消化后按1瓶傳至2～3瓶進行傳代，取其對數生長期細胞進行實驗。

1.3 臺盼藍拒染法檢測細胞活性

取對數生長期的Y1細胞，調整細胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml，F12培養液培養24 h后按照以下分組來添加不同物質：(1) 空白對照組：2 ml F12培養液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH；再按照4個時間點分別培養3、6、12、24 h終止實驗。取細胞上清液于無菌EP中，混勻后以2 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存。在6孔板中按1∶10加入0.4%的臺盼藍，染色2～3 min，在光學顯微鏡下做活細胞計數，實驗重復3次。結果統計：光鏡下任取5個視野進行活細胞計數，細胞活性=活細胞數目/總細胞數目×100%。

1.4 放免法檢測皮質醇

從冰箱中取出經1.3方法處理的上清液，室溫溶解后通過放免法測定各組細胞上清中皮質醇含量。根據皮質醇放免檢測試劑盒的操作說明，用放免儀測各管沉淀的放射性計數(cmp)，實驗重復3次。自動γ計數器預先編制程序，直接給出實驗的有關參數，標準曲線及樣品濃度。測得的數據中，皮質醇以g·ml-1為單位。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測StAR mRNA的表達

取對數生長期的Y1細胞，調整細胞濃度為1.0×105ml-1，接種于6孔板，每孔1 ml。以F12培養液培養24 h 后按照以下分組來添加不同物質：(1) 空白對照組：2 ml F12培養液；(2) IL- 6組：2 ml F12培養液含100 ng·ml-1IL- 6；(3) ACTH組：2 ml F12培養液含10-9mol·l-1ACTH；(4) IL- 6+ACTH組：2 ml F12培養液含100 ng·ml-1IL- 6和10-9mol·l-1ACTH;24 h終止實驗。用Trizol裂解細胞提取各組總RNA，純化后用DEPC水溶解RNA，并分別在260 nm和280 nm處測其吸光度，計算出OD260/280值。引物是根據GenBank收錄的小鼠StAR和GAPDHmRNA序列，由Primer 5軟件設計，由上海英俊公司合成，序列見表1。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行操作，得到cDNA。用ABI Step one plus Real time- PCR儀進行擴增反應，體系總體積為20 μl：SYBR Green為10 μl，cDNA為 1 μl，引物為2 μl，0.1% DEPC水為7 μl。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40個循環，72 ℃延伸40 s。每個樣品3個復孔，于72 ℃、40 s時計算熒光值，實驗重復3次。用2-ΔΔCT法進行數據分析。

表1用于實時熒光定量PCR的引物序列

Tab1SequencesoftheprimersusedforrealtimeRT-PCR

引物名稱引物序列GAPDHSense primer:5-AAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3Antisense primer:5-AGATGATGACCCTTTTGGCTC-3StARSense primer:5-CTTGGCTGCTCAGTATTGAC-3Antisense primer:5-TGGTGGACAGTCCTTAACAC-3

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 臺盼藍拒染法檢測細胞活性

見表2。

組 別處理不同時間后Y1細胞的活力/×100%3 h6 h12 h24 h空白對照組60±555±758±560±2IL-6組68±4a70±4a75±3a80±3aACTH組70±10a73±8a79±3a84±5aIL-6+ACTH組75±15a75±10a85±10a90±15a

與空白對照組比較，aP>0.05

實驗結果顯示：IL- 6單獨或聯合ACTH處理Y1細胞不同時間后，各組的細胞活力與空白對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。隨著時間增加，各組細胞活力雖有明顯增強，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 IL- 6單獨或聯合ACTH處理Y1細胞后皮質醇的合成量

見圖1。

與空白對照組比較，aP<0.05

Fig1ThesynthesisofcorticosteroidinY1cellstreatedbyⅠL- 6aloneorcombinedwithACTH

實驗結果顯示：隨著IL- 6處理Y1細胞的時間增加，皮質醇合成量也增加，與空白對照組比較，差異有統計學意義(6 h后，P<0.05)；ACTH處理Y1細胞不同時間段，隨時間增加，皮質醇合成顯著增加，與空白對照組相比，差異有統計學意義(3 h后，P<0.05)；IL- 6和ACTH聯合作用Y1細胞，隨時間增加，皮質醇合成量進一步上升，與空白對照組相比，差異有統計學意義(3 h后，P<0.05)。

2.3 IL- 6單獨或聯合ACTH處理Y1細胞后StAR mRNA的表達

見表3。

組 別StAR mRNA△CTFold(2-△△CT)空白對照組9.83±0.151.00±0.11IL-6組9.10±0.151.67±0.17ACTH組8.90±0.062.06±0.34IL-6+ACTH組8.40±0.352.75±0.61

實驗結果顯示：IL- 6、ACTH分別作用于Y1細胞24 h后，StAR mRNA的表達增強，與空白對照組對比有統計學意義(P<0.05)；IL- 6和ACTH聯合處理Y1細胞24 h后，StAR mRNA的表達進一步增強，與空白對照組對比有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

2000年，Annane等首次提出相對腎上腺皮質功能不全(relative adrenal cortical dysfunction，RAI)的概念：即處于嚴重應激狀態時，患者體內的皮質醇水平代償性升高，但升高程度或者持續時間仍不能滿足機體需要，即為RAI[1]。Dalegrave等研究發現，內毒素休克患者并發RAI的概率達22%～55%[2]。內毒素休克時RAI發生機制尚不完全清楚，但內毒素休克時大量釋放的炎性因子與腎上腺皮質功能密切相關。IL- 6是參與內毒素休克的重要炎癥因子之一，對腎上腺皮質功能的影響值得進一步探討。

近年來研究發現，細胞因子與腎上腺皮質激素的合成密切相關：腫瘤壞死因子- α可抑制牛腎上腺皮質細胞合成皮質醇[3]，白介素4可促進牛腎上腺皮質細胞合成皮質醇[4]。體外實驗結果表明，采用不同濃度(10～200 ng·ml-1)的IL- 6處理從腎口腺皮質細胞不同時間(4～24 h)后皮質醇合成量開始增加[5]。

本研究前實驗分別用1、10、100 pg·ml-1和1、10、100、200、400 ng·ml-1的IL- 6同時處理Y1細胞，12 h后發現，當IL- 6濃度達1 ng·ml-1后細胞合成皮質醇量增加，100 ng·ml-1皮質醇合成量增加達峰值，超過100 ng·ml-1皮質醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6分別處理Y1細胞3、6、12、24、48 h，發現作用6 h后Y1細胞合成皮質醇量增加，24 h達到峰值，超過24 h后皮質醇合成量開始下降；用100 ng·ml-1IL- 6聯合10-9mol·l-1ACTH處理細胞3 h后皮質醇合成量明顯增加。這些濃度、時間差異性的產生可能與細胞種屬、細胞活性及培養環境相關，也可能與實驗試劑的質量相關。

有研究結果顯示，IL- 6(4.8×10-9mol·L-1)處理腎上腺皮質細胞48 h后細胞數量及細胞活力均無變化[6]。本研究用100 ng·ml-1IL- 6單獨以及聯合10-9mol·l-1ACTH共同處理Y1細胞不同時間后發現，細胞活性與對照組相比差異無統計學意義。因此，后續實驗中使用100 ng·ml-1的IL- 6及10-9mol·L-1的ACTH，排除IL- 6和(或)ACTH對Y1細胞活性的影響。

綜上所述，IL- 6可促進Y1細胞合成皮質醇，但其具體機制仍不明確。2004年，Rainey等[7]研究發現了腎上腺皮質細胞的皮質醇合成通路，即在腎上腺皮質以膽固醇為基本“原料”，通過StAR介導，進入線粒體內膜后經過一系列特異性酶催化作用，包括多種形式的細胞色素P450系列酶和3β羥基固醇脫氫酶(3 beta hydroxy cholesterol dehydrogenase，3β- HSD)，最終合成皮質醇。Y1細胞系是一種研究腎上腺類固醇合成與代謝途徑中多種基因表達和調控的較好細胞模型，其功能與原代腎上腺皮質細胞相似，受ACTH刺激后，細胞合成類固醇能力可顯著增加。本研究采用10-9mol·L-1的ACTH刺激Y1細胞后，皮質醇合成量明顯增加，間接證明了Y1細胞活性良好。

細胞因子的生物學功能是通過與靶細胞膜表面的受體相結合并將信號傳遞到細胞內部，進而發揮功能。Kontogeogos等應用免疫組化和免疫定位方法在人腎上腺皮質的束狀帶、網狀帶以及球狀帶區域檢測到高水平IL- 6和IL- 6受體的表達[8]。IL- 6可能通過與Y1細胞表面IL- 6受體結合成IL- 6/IL- 6R/gp130六聚體蛋白復合物，激活細胞內的JAK/STAT途徑和Ras/MAPK信號轉導途徑，影響細胞合成皮質醇[9]。但有研究[6]結果顯示，IL- 6是通過花生四烯酸代謝途徑調節腎上腺皮質細胞的類固醇激素分泌功能。

本研究結果提示，IL- 6聯合ACTH可明顯促進Y1細胞合成皮質醇，分析其原因可能是：(1) ACTH可促進離體的牛腎上腺皮質細胞分泌IL- 6[10]。本研究中ACTH聯合IL- 6處理Y1細胞時可能促進Y1細胞分泌IL- 6或表達IL- 6R。(2) ACTH通過與腎上腺細胞表面受體結合后，在Ca2+調節下激活腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)產生第二信使環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)，進一步激活蛋白激酶(Protein Kinase，PKA)信號轉導途徑，影響腎上腺細胞分泌類固醇激素[11]。曾有學者推測，ACTH與IL- 6之間可能存在關于cAMP的信號串擾，共同促進腎上腺皮質細胞合成皮質醇。有研究[6]發現，IL- 6通過花生四烯酸環氧酶途徑促進ACTH刺激狀態下的腎上腺皮質細胞合成皮質醇，而非ACTH依賴的cAMP途徑。

細胞因子與其受體結合后啟動復雜的細胞內分子間的相互作用，最終引起細胞內基因轉錄的變化。Koldzic- Zivanovic等通過對Y1細胞中StAR以及上游的膽固醇側鏈裂解酶P450scc(cholesterol side- chain cleavage enzyme P450scc，CYP11A1)和3β- HSD的檢測發現，IL- 10通過與ACTH共同作用來抑制上述蛋白的合成[12]。本研究亦發現，IL- 6單獨或聯合ACTH處理Y1細胞后，StAR mRNA的表達水平上升，提示IL- 6可單獨或聯合ACTH通過促進StAR mRNA表達增強Y1細胞合成皮質醇的能力。目前，有關IL- 6對StAR mRNA表達的影響機制尚不明確。影響StAR mRNA表達的因素主要有cAMP- PKA信號通路、蛋白激酶C、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、類固醇合成因子- 1、X染色體基因- 1、妊娠特異性β- 1糖蛋白、類固醇誘導蛋白等[13]。在類固醇合成細胞中，AA從細胞器釋放是類固醇合成所必需的。許多研究結果顯示，AA與IL- 6關系密切，如AA可進一步誘導缺氧狀態下的小鼠胚胎干細胞分泌IL- 6[14]；IL- 6促進體外血小板活化的機制包括AA誘導途徑[15]等。有報道，IL- 6通過AA代謝途徑調節腎上腺細胞分泌皮質醇激素。研究顯示IL- 6通過抑制磷脂酶A2的活性，使AA代謝受阻，進一步使StAR蛋白表達受到抑制而影響類固醇激素的合成[16]，并且StAR蛋白表達受阻出現在轉錄水平[17]，有可能是通過降低轉錄活性或mRNA的穩定性實現的。因此，推測IL- 6對StAR mRNA表達的影響可能通過花生四烯酸脂氧酶代謝途徑進行。探討IL- 6與ACTH共同影響StAR表達機制的文獻比較少，是否通過促進cAMP誘導作用或花生四烯酸代謝途徑以及其他可能的調節途徑，這需要進一步研究。

近些年來，腎上腺皮質功能的損害在內毒素休克發生發展中的作用已逐漸成為研究熱點。腎上腺皮質功能狀態對內毒素休克的治療和預后評估非常重要，而IL- 6是內毒素休克發生過程中重要的細胞因子。本研究結果表明，IL- 6與腎上腺皮質細胞功能密切相關。因此，深入探討IL- 6對腎上腺皮質功能的影響及其機制將為臨床治療提供實驗基礎和理論依據。

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