小鼠骨髓來源內皮祖細胞的分離、培養及鑒定

胡若愚，承燕，李好，張雷，景華，吳海衛

(南京大學臨床醫學院 南京軍區南京總醫院 心胸外科，江蘇 南京 210002)

血液循環是機體生命維持的重要保證。血管內皮作為血液與周圍組織的分界，在血液循環的穩定性的維持中起著非常重要的作用[1]。自1997年Asahara首次報道經由外周血獲得內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)以來，EPC因其具有的強大增殖潛能及向血管內皮細胞分化的特性，越來越引起廣大醫學科研工作者的重視[2]。研究表明，EPC作為血管內皮細胞的前體細胞，不僅有著強大的增殖及分化能力，更具備向缺血或受損組織遷移、歸巢的特性，在血管新生及內皮修復中起著獨特而關鍵的作用。實驗研究發現，EPC不僅是冠心病發病預測的獨立危險因素，更在心肌梗死后的血管新生中發揮重要作用[3- 4]；利用EPC移植治療冠心病及心肌梗死也取得了良好的效果[5]；利用EPC治療肢體缺血的試驗研究顯示出EPC具有強大的促血管新生能力，能夠明顯地促進閉塞血管周圍組織內的血管新生[6- 7]。與此同時，由于生理狀態下循環血液中的EPC含量極低，僅占外周血中有核細胞數量的0.01%～0.02%[8]，而在冠心病、吸煙人群、糖尿病、老齡人等特定人群中，循環血中的EPC數量會進一步降低[9- 11]。因此，當心肌梗死等突發疾病發生時，患者自體外周血中的EPC數量往往不能在第一時間滿足血管修復及再生的需要。因此，通過體外培養及擴增的方法預先獲得充足的EPC，并在疾病發生后迅速予以患者輸入外源性EPC應當是EPC治療的重要方法乃至必由之路。

EPC的獲取來源及培養方法各家報道不一，而自骨髓提取骨髓單核細胞接種進行細胞培養是目前國外研究所廣泛采用的主流培養方法。該方法穩定、高效、經濟，且能有效避免細胞獲取過程中的細胞污染。特別是在小鼠等外周血量極少的小動物研究中，更具有其獨特的可操作性。本研究采用BALB/c小鼠骨髓獲得單核細胞，分離培養并鑒定骨髓來源的小鼠EPC，為今后EPC的細胞學治療研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及主要儀器

BALB/c小鼠(雄性，5～7周齡，體重21～25 g·只-1，由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供)；EGM- 2 SingleQuots培養基(美國Lonza公司)；人纖維連接蛋白 (美國R&D公司)；小鼠淋巴細胞分離液 (美國Sigma- Aldrich公司)；大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體、兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(均購自英國Abcam公司)；羊抗大鼠IgG- FITC抗體、羊抗兔IgG- PE抗體(均購自美國SantaCruz公司);DiI- Ac- LDL(美國Invitrogen公司);FITC- UEA- 1(美國Sigma- Aldrich公司);抗小鼠 CD34- FITC流式抗體、抗小鼠VEGFR2- PE流式抗體、大鼠IgG2aK- PE 同型對照流式抗體、大鼠IgG2aK- FITC同型對照流式抗體 (均購自美國eBioscience公司)。超凈工作臺(蘇凈集團)，細胞培養箱(美國Thermo公司)，水平離心機(上海醫用分析儀器廠)，流式細胞儀(美國BD公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分離與培養

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉后推頭法迅速處死并置入75%酒精中浸泡30 min。于超凈工作臺上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離并取出，浸泡于含胎牛血清的PBS溶液中保存。以1 ml注射器及PBS沖洗小鼠脛、股骨骨髓腔，沖洗獲得的骨髓細胞懸液收集于15 ml離心管中。每次沖洗PBS液量為6 ml。將4 ml小鼠淋巴細胞分離液加入離心管底部，并將獲得的骨髓細胞懸液沿離心管壁緩慢加入離心管中。將該離心管于水平離心機中離心，以2 500 r·min-1離心30 min。離心后可觀察到離心管內液體分為3層：底層為紅細胞層；中層可觀察到約2～3 mm厚的白膜層，此即為單核細胞層；上層為血清層。以無菌吸管將白膜層吸出，以無菌PBS液洗滌所獲細胞2次，并以1 ml EGM- 2 SingleQuots培養液定容、混勻，制成母液。細胞計數板計數后，以5×106孔-1細胞量將細胞接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養板中，每孔內培養液為2 ml。將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞接種后第4天首次更換細胞培養液，棄去未貼壁細胞，將貼壁細胞繼續培養。此后每2 d更換培養液1次。細胞培養3周，每日觀察細胞生長狀態，并拍照留存。

1.3 小鼠EPC的鑒定

1.3.1 細胞表面抗原免疫熒光法鑒定 選用培養至第21天的EPC行細胞表面抗原免疫熒光法鑒定，方法如下：(1) 細胞接種前于細胞培養板各孔內投入1 cm×1 cm無菌載玻片1枚，并行人纖維連接蛋白包被。細胞接種時，將細胞懸液滴加于載玻片上，并輕輕搖勻，使細胞于孔內均勻分布。細胞培養方法同前。(2) 細胞培養至21 d后取出載玻片，并以用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，山羊封閉血清作用30 min，分別加入大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(1∶50)及兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(1∶100),并于4 ℃孵育過夜。次日，以PBS漂洗3次后，加入羊抗大鼠IgG- FITC抗體(1∶200)及羊抗兔IgG- PE抗體(1∶500)，常溫下孵育1 h。(3) PBS漂洗2遍后，以10%緩沖甘油封片。于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞CD34及VEGFR2表達情況。

1.3.2 細胞表面抗原流式細胞儀檢測 選擇培養至第21天的EPC行流式細胞儀檢測，具體方法如下：(1) 吸去細胞培養液，并以PBS洗滌細胞2遍，以充分去除培養液及死亡的懸浮細胞。(2) 選用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞后收集并用血清中和。(3) 離心并以PBS洗滌細胞2次，細胞重懸后計數并收集5×105細胞待檢，加入抗小鼠CD34- FITC、VEGFR2- PE流式抗體各10 μl。常溫下避光孵育1 h。(4) 1 h后再次離心，棄去上清，并以500 μl PBS重懸細胞后上機檢測。流式細胞檢測定標采用同型對照抗體標記細胞，方法同上。

1.3.3 細胞功能檢測 選用培養第21天的EPC行細胞功能檢測，具體方法如下：(1) 細胞爬片及培養方法同前。(2) 培養21 d后取出載玻片，將1 ml含10 μg·ml-1DiI- ac- LDL 的EGM- 2 SingleQuots培養液加入培養孔中，并于37 ℃細胞培養箱內孵育 2 h。(3) 2 h后取出培養板，并以PBS洗滌載玻片2次，4%多聚甲醛固定30 min。再次以PBS洗滌載玻片2次。并加入FITC標記的荊豆凝集素2 ml，FITC- UEA- 1濃度為10 μg·ml-1，常溫下孵育1 h。(4) 1 h后取出載玻片， PBS洗滌2遍后10%緩沖甘油封片。(5) 熒光倒置顯微鏡下觀察細胞吞噬DiI- ac- LDL及結合FITC- UEA- 1情況并拍攝照片。

2 結 果

2.1 細胞形態

骨髓單核細胞接種于細胞培養板上，起初為密集的小圓形細胞(圖1A)。48 h可觀察到細胞開始變大。接種第4天行首次更換培養液后，將培養板內絕大多數未貼壁細胞去除。貼壁細胞開始逐漸出現加速生長趨勢，細胞向梭型細胞轉變，細胞體積進一步增大。細胞接種后第7天左右，培養板內可觀察到多個細胞集落出現。細胞集落形態為：中間小圓形細胞聚集成團，周圍長梭型細胞呈放射狀排列(圖1B)。此后，細胞集落生長速度進一步增快，集落數量也逐漸增多，集落周邊細胞也逐漸由長梭型向短梭形轉變。在此期間，可觀察到部分細胞排列出現極性，呈現管狀(圖1C)、網狀樣(圖1D)生長，提示EPC具有成血管特性。培養至2周后，細胞集落逐漸消失，細胞形態趨于均一，呈現“鋪路石”樣生長狀態(圖1E)。

2.2 免疫熒光檢測

免疫熒光檢測結果顯示，培養至3周后細胞絕大多數能被CD34及VEGFR2同時標記。熒光顯微鏡下可見CD34標記陽性細胞呈綠色熒光，VEGFR2標記陽性細胞呈紅色熒光。通過于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成雙色熒光，可見共表達CD34及VEGFR2細胞呈現橙色，提示該細胞即為EPC(圖2)。

2.3 流式細胞儀檢測

本研究采用流式細胞儀計量培養細胞中共表達CD34及VEGFR2細胞比例。根據流式細胞儀檢測結果，本研究所培養至3周后的細胞中，CD34及VEGFR2雙陽性細胞比例均占培養細胞總量的85%以上，提示檢測細胞絕大多數為EPC (圖3)。

A.骨髓單核細胞接種于人纖維連接蛋白包被的培養板中；B.細胞培養第7天出現細胞集落(箭頭所指)；C.培養期間，部分細胞呈現管狀生長(箭頭所指);D. 細胞呈網狀樣生長(箭頭所指為網狀樣生長的EPC，圖中心箭頭所指為EPC細胞集落)；E.培養至2周后，細胞形態呈現“鋪路石”樣生長狀態

圖1細胞形態

A. Bone marrow mononuclear cells were seeded in the human fibronectin- coated flasks; B. Colony forming unit appeared since the 7thday of culture(arrow); C. During the cell culture， EPC were found arranging in a tube- like(arrow); D. EPC were net- like(arrow indicated the EPC network， figure center arrow indicated the EPC cell forming unit); E. EPC gradually changed to a cobblestone- like morphology after 2 weeks of culture．

Fig1Cellmorphology

2.4 細胞功能檢測

EPC具備吞噬乙酰化低密度脂蛋白能力及結合荊豆凝集素能力。本研究結果顯示,所培養的細胞絕大多數具備吞噬DiI- Ac- LDL及結合FITC- UEA- 1能力。熒光顯微鏡下可見，吞噬DiI- Ac- LDL的EPC胞漿內呈現紅色熒光，結合FITC- UEA- 1的EPC細胞膜呈現綠色熒光。通過于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成熒光染色照片，可見雙陽性細胞呈現橙色熒光，提示該細胞即為EPC(圖4)。

3 討 論

EPC是一類可以分化為成熟內皮細胞的前體細胞，由中胚層的成血管母細胞分化而來。EPC不僅參與人體胚胎血管形成，同時也參與出生后血管形成、再內皮化和機體血管損傷后的修復過程[12- 13]。隨著研究的不斷進展，科研工作者相繼從骨髓、臍血、胚胎肝臟及外周血中分離并提取出EPC。其中，骨髓中EPC含量最高，為外周血中的15倍[14- 15]。因此，自骨髓中提取EPC是一種更加簡便、高效的細胞提取方法。特別是對諸如小鼠等外周血量極少的小動物，從骨髓細胞中分離獲取單核細胞并誘導分化為EPC的細胞培養方法有著其他方法不可比擬的優勢。在本次實驗中，我們選擇了自骨髓單核細胞誘導培養EPC的方法。通過實驗研究我們發現，該方法簡便、高效、易行。實驗中我們發現：自每只小鼠雙下肢股骨、腓骨骨髓中可獲得的單核細胞數量大約為1×107個左右。完全可以滿足細胞接種及培養需要。我們還發現：選擇5～7周齡的小鼠進行骨髓細胞提取，可以獲得更多的骨髓單核細胞，過老或過小的小鼠，骨髓單核細胞提取效率則相對較低。有研究表明：人纖維連接蛋白能夠促進內皮祖細胞的黏附、生長及增殖。因此，在我們的實驗中也采用了預先使用人纖維連接蛋白進行細胞培養板包被的方法。通過比較我們發現：通過使用人纖維連接蛋白進行細胞培養板包被能有效地提高細胞的黏附效率，并能有力地促進細胞增殖及細胞集落的形成[16]。

共表達CD34及VEGFR2細胞呈現橙色，提示該細胞即為EPC

圖2CD34、VEGFR2雙陽性免疫熒光染色

Cells co- expressing CD34 and VEGFR2 exhibited orange fluoresce-nce and were considered as EPC

Fig2ImmunofluorescencestainingofCD34andVEGFR2

細胞培養至3周后，CD34及VEGFR2雙陽性細胞比例均占培養細胞總量的85%以上

圖3CD34、VEGFR2流式細胞儀檢測

Over 85% of sample cells cultured over 3 weeks co- expressed CD34 and VEGFR2

Fig3CD34andVEGFR2flowcytometerdetermination

DiI、FITC雙陽性細胞呈現橙色熒光，提示該細胞即為EPC

圖4EPC吞噬DiI-Ac-LDL及結合FITC-UEA-lectin檢測

Cells double positive for DiI and FITC showed orange fluorescence were considered as EPC

Fig4DeterminationofDiI-Ac-LDLuptakeandFITC-UEA-LectinbindingofculturedEPC

關于EPC的培養方法各類文獻報道不一，其主要區別在于單核細胞接種后，培養未貼壁細胞還是貼壁細胞。Prater等回顧分析了2種細胞培養方法，結果發現，兩種方法均可培養獲得EPC。但其區別在于將早期未貼壁細胞留取，進行后續培養所獲得的細胞與Asahara所報道的相似，為中央圓形細胞聚集，周圍為梭型細胞，并呈放射狀分布，該類細胞目前又被稱為colony forming unit- EC(CFU- EC)或早期內皮祖細胞(early- EPC)；而棄去早期未貼壁細胞，而將貼壁細胞留取培養，所獲得的細胞呈現“鋪路石樣”外觀，此類細胞目前又被稱為endothelial colony forming cell(ECFC)或晚期內皮祖細胞(late- EPC)[17]。而根據Hur等進行的針對這兩類細胞的研究表明，早期EPC出現在細胞培養的第2～3周，第4周左右消失，細胞形態為梭形；晚期EPC在細胞第4～8周左右出現，并可生長至第12周左右，細胞集落呈現“鋪路石”樣形態[18]。研究還表明：晚期EPC在細胞增殖能力、成血管能力及對受損內皮細胞的修復能力上，均較早期EPC有顯著提高。而關于兩類EPC亞型之間的關系及來源，目前各種報道觀點不一，甚至有觀點認為兩類EPC是由兩種不同細胞分化而來[19]。在本研究中，我們發現所培養的細胞先后出現了早期及晚期EPC的細胞形態，該現象提示我們：晚期EPC很可能是由早期EPC演化而來，而并不是一類單獨的細胞來源。

EPC的鑒定目前仍然缺乏獲得廣泛公認的“金標準”。根據目前已有文獻報道和研究所普遍采用的鑒定方法，認為EPC的鑒定應包括細胞形態學鑒定、細胞表面抗原鑒定及細胞功能測定。EPC的早期及晚期的形態學特征差異較大。值得注意的是，我們在培養過程中，多次發現細胞生長出現極性排列現象，特別是出現細胞首尾相接并呈現管狀生長，以及由一個大的細胞集落生發出網狀排列細胞的生長現象。這些現象在其他細胞培養中尚屬少見，更加強烈地顯示出EPC作為血管內皮細胞的成血管特性。同時，我們還發現：EPC的增殖能力極強，特別是生長至2周左右之后，其增殖加速現象格外明顯，提示EPC具有遲發型高增殖能力。有報道表明，EPC的增殖能力是內皮細胞增殖能力的50倍左右[20]。關于EPC的細胞表面標志的鑒定標準，目前各家觀點不一。根據Asahara等的首次報道，認為EPC應同時表達CD34、CD133及VEGFR2。早期EPC還表達白細胞通用抗原CD45。但隨著研究的不斷深入，目前觀點認為，EPC的細胞表面標志是一個動態變化過程，隨著EPC向內皮細胞逐漸分化，干細胞標志物CD133及白細胞標志物CD45表達會逐漸降低以致丟失。由于EPC是由造血干細胞分化而來，目前觀點認為，EPC應至少表達一個造血干細胞標記物CD34及反應內皮細胞特征的細胞標記物VEGFR2或CD31[16]。而Schmidt- lucke等提出的鑒定外周血中EPC的流式細胞鑒定方法也將CD45弱陽性、CD34、VEGFR2雙陽性作為定義EPC的檢測標準[8]。在本次研究中，我們也選用CD34與VEGFR2雙陽性表達鑒定培養獲得的EPC。根據免疫熒光及流式細胞儀檢測結果，超過85%的細胞共表達上述兩抗原。提示所培養細胞確為EPC。關于EPC功能的檢測，目前主流的檢測方法為測定EPC吞噬乙酰化低密度脂蛋白及結合荊豆凝集素能力。該檢測方法曾被廣泛采用，甚至有研究僅使用該方法進行EPC鑒定[21]。隨著對EPC研究的發展及認識的深入，科研工作者發現，該功能并非EPC所特有，其他細胞如內皮細胞也具有此類功能。因此，該檢測方法只能作為EPC鑒定的輔助手段，而完全依賴該方法進行EPC鑒定顯然不夠嚴謹。

綜上所述，通過本項研究，我們確立了一套自通過分離小鼠骨髓單核細胞進行EPC誘導培養的培養方法。并通過細胞形態學觀察、細胞表面抗原測定及細胞功能檢測3方面確定我們所培養的細胞為EPC,為今后利用EPC進行相關科學研究奠定了基礎。

[1] 張鐵須，周建中.內皮祖細胞與高血壓病[J].現代醫學,2008,36(2):141- 144．

[2] ASAHARA T,MUROHARA T,SULLIVAN A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964- 967.

[3] JI A L,TAKAHASHI M,YOSHIOKA T,et al.Therapeutic potential of endothelial progenitor cells for cardiovascular diseases[J].Curr Vasc Pharmacol ,2006,4(1):59- 65.

[4] STELLOS K,BIGALKE B,LANGER H,et al.Expression of stromal- cell- derived factor- 1 on circulating platelets is increased in patients with acute coronary syndrome and correlates with the number of CD34+progenitor cells[J].Eur Heart J,2009,30(5):584- 593.

[5] HU C H,WU G F,WANG X Q,et al.Transplanted human umbilical cord blood mononuclear cells improve left ventricular function through angiogenesis in myocardial infarction[J].Chinese Med J,2006,119(18):1499- 1506.

[6] DEVANESAN A J,LAUGHLAN K A,GIRN H R,et al.Endothelial progenitor cells as a therapeutic option in peripheral arterial disease[J].Eur J Vas Endovasc,2009,38(4):475- 481.

[7] IWAGURO H,YAMAGUCHI J,KALKA C,et al.Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration[J].Circulation,2002,105(6):732- 738.

[8] SCHMIDT- LUCKE C,FICHTLSCHERER S,Aicher A,et al.Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol[J].PloS One,2010,5(11):e13790.

[9] FADINI G P,SARTORE S,BAESSO I,et al.Endothelial progenitor cells and the diabetic paradox[J].Diabetes Care,2006,29(3):714- 716.

[10] di STEFANO R,BARSOTTI M C,FELICE F,et al.Smoking and endothelial progenitor cells:a revision of literature[J].Cur Pharm Design ,2010,16(23):2559- 2566.

[11] WERNER N,WASSMANN S,AHLERS P,et al.Endothelial progenitor cells correlate with endothelial function in patients with coronary artery disease[J].Basic Res Cardiol,2007,102(6):565- 571.

[12] BONELLO L,BASIRE A,SABATIER F,et al.Endothelial injury induced by coronary angioplasty triggers mobilization of endothelial progenitor cells in patients with stable coronary artery disease[J].J Thromb Haemost,2006,4(5):979- 981.

[13] YAMADA M,KUBO H,ISHIZAWA K,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia:evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair[J].Thorax,2005,60(5):410- 413.

[14] EGGERMANN J,KLICHE S,JARMY G,et al.Endothelial progenitor cell culture and differentiationinvitro:a methodological comparison using human umbilical cord blood[J].Cardiovasc Res,2003,58(2):478- 486.

[15] LIN Y,WEISDORF D J,SOLOVEY A,et al.Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].J Clin Invest,2000,105(1):71- 77.

[16] YODER M C,MEAD L E,PRATER D,et al.Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals[J].Blood,2007,109(5):1801- 1809.

[17] PRATER D N,CASE J,INGRAM D A,et al.Working hypothesis to redefine endothelial progenitor cells[J].Leukemia,2007,21(6):1141- 1149.

[18] HUR J,YOON C H,KIM H S,et al.Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis[J].Arterioscl Throm Vas,2004,24(2):288- 293.

[19] FADINI G P,BAESSO I,ALBIERO M,et al.Technical notes on endothelial progenitor cells:ways to escape from the knowledge plateau[J].Atherosclerosis,2008,197(2):496- 503.

[20] RAE P C,KELLY R D,EGGINTON S,et al.Angiogenic potential of endothelial progenitor cells and embryonic stem cells[J].Vascular Cell,2011,3:11.

[21] THOMAS R A,PIETRZAK D C,SCICCHITANO M S,et al.Detection and characterization of circulating endothelial progenitor cells in normal rat blood[J].J Pharmacol Toxicol.2009,60(3):263- 274．