小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

胡若愚，承燕，李好，張雷，景華，吳海衛(wèi)

(南京大學臨床醫(yī)學院 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 心胸外科，江蘇 南京 210002)

血液循環(huán)是機體生命維持的重要保證。血管內(nèi)皮作為血液與周圍組織的分界，在血液循環(huán)的穩(wěn)定性的維持中起著非常重要的作用[1]。自1997年Asahara首次報道經(jīng)由外周血獲得內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)以來，EPC因其具有的強大增殖潛能及向血管內(nèi)皮細胞分化的特性，越來越引起廣大醫(yī)學科研工作者的重視[2]。研究表明，EPC作為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，不僅有著強大的增殖及分化能力，更具備向缺血或受損組織遷移、歸巢的特性，在血管新生及內(nèi)皮修復中起著獨特而關鍵的作用。實驗研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅是冠心病發(fā)病預測的獨立危險因素，更在心肌梗死后的血管新生中發(fā)揮重要作用[3- 4]；利用EPC移植治療冠心病及心肌梗死也取得了良好的效果[5]；利用EPC治療肢體缺血的試驗研究顯示出EPC具有強大的促血管新生能力，能夠明顯地促進閉塞血管周圍組織內(nèi)的血管新生[6- 7]。與此同時，由于生理狀態(tài)下循環(huán)血液中的EPC含量極低，僅占外周血中有核細胞數(shù)量的0.01%～0.02%[8]，而在冠心病、吸煙人群、糖尿病、老齡人等特定人群中，循環(huán)血中的EPC數(shù)量會進一步降低[9- 11]。因此，當心肌梗死等突發(fā)疾病發(fā)生時，患者自體外周血中的EPC數(shù)量往往不能在第一時間滿足血管修復及再生的需要。因此，通過體外培養(yǎng)及擴增的方法預先獲得充足的EPC，并在疾病發(fā)生后迅速予以患者輸入外源性EPC應當是EPC治療的重要方法乃至必由之路。

EPC的獲取來源及培養(yǎng)方法各家報道不一，而自骨髓提取骨髓單核細胞接種進行細胞培養(yǎng)是目前國外研究所廣泛采用的主流培養(yǎng)方法。該方法穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟，且能有效避免細胞獲取過程中的細胞污染。特別是在小鼠等外周血量極少的小動物研究中，更具有其獨特的可操作性。本研究采用BALB/c小鼠骨髓獲得單核細胞，分離培養(yǎng)并鑒定骨髓來源的小鼠EPC，為今后EPC的細胞學治療研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及主要儀器

BALB/c小鼠(雄性，5～7周齡，體重21～25 g·只-1，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供)；EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)基(美國Lonza公司)；人纖維連接蛋白 (美國R&D公司)；小鼠淋巴細胞分離液 (美國Sigma- Aldrich公司)；大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體、兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(均購自英國Abcam公司)；羊抗大鼠IgG- FITC抗體、羊抗兔IgG- PE抗體(均購自美國SantaCruz公司);DiI- Ac- LDL(美國Invitrogen公司);FITC- UEA- 1(美國Sigma- Aldrich公司);抗小鼠 CD34- FITC流式抗體、抗小鼠VEGFR2- PE流式抗體、大鼠IgG2aK- PE 同型對照流式抗體、大鼠IgG2aK- FITC同型對照流式抗體 (均購自美國eBioscience公司)。超凈工作臺(蘇凈集團)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，水平離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)，流式細胞儀(美國BD公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分離與培養(yǎng)

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉后推頭法迅速處死并置入75%酒精中浸泡30 min。于超凈工作臺上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離并取出，浸泡于含胎牛血清的PBS溶液中保存。以1 ml注射器及PBS沖洗小鼠脛、股骨骨髓腔，沖洗獲得的骨髓細胞懸液收集于15 ml離心管中。每次沖洗PBS液量為6 ml。將4 ml小鼠淋巴細胞分離液加入離心管底部，并將獲得的骨髓細胞懸液沿離心管壁緩慢加入離心管中。將該離心管于水平離心機中離心，以2 500 r·min-1離心30 min。離心后可觀察到離心管內(nèi)液體分為3層：底層為紅細胞層；中層可觀察到約2～3 mm厚的白膜層，此即為單核細胞層；上層為血清層。以無菌吸管將白膜層吸出，以無菌PBS液洗滌所獲細胞2次，并以1 ml EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)液定容、混勻，制成母液。細胞計數(shù)板計數(shù)后，以5×106孔-1細胞量將細胞接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)培養(yǎng)液為2 ml。將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞接種后第4天首次更換細胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。此后每2 d更換培養(yǎng)液1次。細胞培養(yǎng)3周，每日觀察細胞生長狀態(tài)，并拍照留存。

1.3 小鼠EPC的鑒定

1.3.1 細胞表面抗原免疫熒光法鑒定 選用培養(yǎng)至第21天的EPC行細胞表面抗原免疫熒光法鑒定，方法如下：(1) 細胞接種前于細胞培養(yǎng)板各孔內(nèi)投入1 cm×1 cm無菌載玻片1枚，并行人纖維連接蛋白包被。細胞接種時，將細胞懸液滴加于載玻片上，并輕輕搖勻，使細胞于孔內(nèi)均勻分布。細胞培養(yǎng)方法同前。(2) 細胞培養(yǎng)至21 d后取出載玻片，并以用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，山羊封閉血清作用30 min，分別加入大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(1∶50)及兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(1∶100),并于4 ℃孵育過夜。次日，以PBS漂洗3次后，加入羊抗大鼠IgG- FITC抗體(1∶200)及羊抗兔IgG- PE抗體(1∶500)，常溫下孵育1 h。(3) PBS漂洗2遍后，以10%緩沖甘油封片。于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞CD34及VEGFR2表達情況。

1.3.2 細胞表面抗原流式細胞儀檢測 選擇培養(yǎng)至第21天的EPC行流式細胞儀檢測，具體方法如下：(1) 吸去細胞培養(yǎng)液，并以PBS洗滌細胞2遍，以充分去除培養(yǎng)液及死亡的懸浮細胞。(2) 選用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞后收集并用血清中和。(3) 離心并以PBS洗滌細胞2次，細胞重懸后計數(shù)并收集5×105細胞待檢，加入抗小鼠CD34- FITC、VEGFR2- PE流式抗體各10 μl。常溫下避光孵育1 h。(4) 1 h后再次離心，棄去上清，并以500 μl PBS重懸細胞后上機檢測。流式細胞檢測定標采用同型對照抗體標記細胞，方法同上。

1.3.3 細胞功能檢測 選用培養(yǎng)第21天的EPC行細胞功能檢測，具體方法如下：(1) 細胞爬片及培養(yǎng)方法同前。(2) 培養(yǎng)21 d后取出載玻片，將1 ml含10 μg·ml-1DiI- ac- LDL 的EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)液加入培養(yǎng)孔中，并于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2 h。(3) 2 h后取出培養(yǎng)板，并以PBS洗滌載玻片2次，4%多聚甲醛固定30 min。再次以PBS洗滌載玻片2次。并加入FITC標記的荊豆凝集素2 ml，F(xiàn)ITC- UEA- 1濃度為10 μg·ml-1，常溫下孵育1 h。(4) 1 h后取出載玻片， PBS洗滌2遍后10%緩沖甘油封片。(5) 熒光倒置顯微鏡下觀察細胞吞噬DiI- ac- LDL及結合FITC- UEA- 1情況并拍攝照片。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)

骨髓單核細胞接種于細胞培養(yǎng)板上，起初為密集的小圓形細胞(圖1A)。48 h可觀察到細胞開始變大。接種第4天行首次更換培養(yǎng)液后，將培養(yǎng)板內(nèi)絕大多數(shù)未貼壁細胞去除。貼壁細胞開始逐漸出現(xiàn)加速生長趨勢，細胞向梭型細胞轉(zhuǎn)變，細胞體積進一步增大。細胞接種后第7天左右，培養(yǎng)板內(nèi)可觀察到多個細胞集落出現(xiàn)。細胞集落形態(tài)為：中間小圓形細胞聚集成團，周圍長梭型細胞呈放射狀排列(圖1B)。此后，細胞集落生長速度進一步增快，集落數(shù)量也逐漸增多，集落周邊細胞也逐漸由長梭型向短梭形轉(zhuǎn)變。在此期間，可觀察到部分細胞排列出現(xiàn)極性，呈現(xiàn)管狀(圖1C)、網(wǎng)狀樣(圖1D)生長，提示EPC具有成血管特性。培養(yǎng)至2周后，細胞集落逐漸消失，細胞形態(tài)趨于均一，呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長狀態(tài)(圖1E)。

2.2 免疫熒光檢測

免疫熒光檢測結果顯示，培養(yǎng)至3周后細胞絕大多數(shù)能被CD34及VEGFR2同時標記。熒光顯微鏡下可見CD34標記陽性細胞呈綠色熒光，VEGFR2標記陽性細胞呈紅色熒光。通過于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成雙色熒光，可見共表達CD34及VEGFR2細胞呈現(xiàn)橙色，提示該細胞即為EPC(圖2)。

2.3 流式細胞儀檢測

本研究采用流式細胞儀計量培養(yǎng)細胞中共表達CD34及VEGFR2細胞比例。根據(jù)流式細胞儀檢測結果，本研究所培養(yǎng)至3周后的細胞中，CD34及VEGFR2雙陽性細胞比例均占培養(yǎng)細胞總量的85%以上，提示檢測細胞絕大多數(shù)為EPC (圖3)。

A.骨髓單核細胞接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板中；B.細胞培養(yǎng)第7天出現(xiàn)細胞集落(箭頭所指)；C.培養(yǎng)期間，部分細胞呈現(xiàn)管狀生長(箭頭所指);D. 細胞呈網(wǎng)狀樣生長(箭頭所指為網(wǎng)狀樣生長的EPC，圖中心箭頭所指為EPC細胞集落)；E.培養(yǎng)至2周后，細胞形態(tài)呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長狀態(tài)

圖1細胞形態(tài)

A. Bone marrow mononuclear cells were seeded in the human fibronectin- coated flasks; B. Colony forming unit appeared since the 7thday of culture(arrow); C. During the cell culture， EPC were found arranging in a tube- like(arrow); D. EPC were net- like(arrow indicated the EPC network， figure center arrow indicated the EPC cell forming unit); E. EPC gradually changed to a cobblestone- like morphology after 2 weeks of culture．

Fig1Cellmorphology

2.4 細胞功能檢測

EPC具備吞噬乙?；兔芏戎鞍啄芰敖Y合荊豆凝集素能力。本研究結果顯示,所培養(yǎng)的細胞絕大多數(shù)具備吞噬DiI- Ac- LDL及結合FITC- UEA- 1能力。熒光顯微鏡下可見，吞噬DiI- Ac- LDL的EPC胞漿內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光，結合FITC- UEA- 1的EPC細胞膜呈現(xiàn)綠色熒光。通過于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成熒光染色照片，可見雙陽性細胞呈現(xiàn)橙色熒光，提示該細胞即為EPC(圖4)。

3 討 論

EPC是一類可以分化為成熟內(nèi)皮細胞的前體細胞，由中胚層的成血管母細胞分化而來。EPC不僅參與人體胚胎血管形成，同時也參與出生后血管形成、再內(nèi)皮化和機體血管損傷后的修復過程[12- 13]。隨著研究的不斷進展，科研工作者相繼從骨髓、臍血、胚胎肝臟及外周血中分離并提取出EPC。其中，骨髓中EPC含量最高，為外周血中的15倍[14- 15]。因此，自骨髓中提取EPC是一種更加簡便、高效的細胞提取方法。特別是對諸如小鼠等外周血量極少的小動物，從骨髓細胞中分離獲取單核細胞并誘導分化為EPC的細胞培養(yǎng)方法有著其他方法不可比擬的優(yōu)勢。在本次實驗中，我們選擇了自骨髓單核細胞誘導培養(yǎng)EPC的方法。通過實驗研究我們發(fā)現(xiàn)，該方法簡便、高效、易行。實驗中我們發(fā)現(xiàn)：自每只小鼠雙下肢股骨、腓骨骨髓中可獲得的單核細胞數(shù)量大約為1×107個左右。完全可以滿足細胞接種及培養(yǎng)需要。我們還發(fā)現(xiàn)：選擇5～7周齡的小鼠進行骨髓細胞提取，可以獲得更多的骨髓單核細胞，過老或過小的小鼠，骨髓單核細胞提取效率則相對較低。有研究表明：人纖維連接蛋白能夠促進內(nèi)皮祖細胞的黏附、生長及增殖。因此，在我們的實驗中也采用了預先使用人纖維連接蛋白進行細胞培養(yǎng)板包被的方法。通過比較我們發(fā)現(xiàn)：通過使用人纖維連接蛋白進行細胞培養(yǎng)板包被能有效地提高細胞的黏附效率，并能有力地促進細胞增殖及細胞集落的形成[16]。

共表達CD34及VEGFR2細胞呈現(xiàn)橙色，提示該細胞即為EPC

圖2CD34、VEGFR2雙陽性免疫熒光染色

Cells co- expressing CD34 and VEGFR2 exhibited orange fluoresce-nce and were considered as EPC

Fig2ImmunofluorescencestainingofCD34andVEGFR2

細胞培養(yǎng)至3周后，CD34及VEGFR2雙陽性細胞比例均占培養(yǎng)細胞總量的85%以上

圖3CD34、VEGFR2流式細胞儀檢測

Over 85% of sample cells cultured over 3 weeks co- expressed CD34 and VEGFR2

Fig3CD34andVEGFR2flowcytometerdetermination

DiI、FITC雙陽性細胞呈現(xiàn)橙色熒光，提示該細胞即為EPC

圖4EPC吞噬DiI-Ac-LDL及結合FITC-UEA-lectin檢測

Cells double positive for DiI and FITC showed orange fluorescence were considered as EPC

Fig4DeterminationofDiI-Ac-LDLuptakeandFITC-UEA-LectinbindingofculturedEPC

關于EPC的培養(yǎng)方法各類文獻報道不一，其主要區(qū)別在于單核細胞接種后，培養(yǎng)未貼壁細胞還是貼壁細胞。Prater等回顧分析了2種細胞培養(yǎng)方法，結果發(fā)現(xiàn)，兩種方法均可培養(yǎng)獲得EPC。但其區(qū)別在于將早期未貼壁細胞留取，進行后續(xù)培養(yǎng)所獲得的細胞與Asahara所報道的相似，為中央圓形細胞聚集，周圍為梭型細胞，并呈放射狀分布，該類細胞目前又被稱為colony forming unit- EC(CFU- EC)或早期內(nèi)皮祖細胞(early- EPC)；而棄去早期未貼壁細胞，而將貼壁細胞留取培養(yǎng)，所獲得的細胞呈現(xiàn)“鋪路石樣”外觀，此類細胞目前又被稱為endothelial colony forming cell(ECFC)或晚期內(nèi)皮祖細胞(late- EPC)[17]。而根據(jù)Hur等進行的針對這兩類細胞的研究表明，早期EPC出現(xiàn)在細胞培養(yǎng)的第2～3周，第4周左右消失，細胞形態(tài)為梭形；晚期EPC在細胞第4～8周左右出現(xiàn)，并可生長至第12周左右，細胞集落呈現(xiàn)“鋪路石”樣形態(tài)[18]。研究還表明：晚期EPC在細胞增殖能力、成血管能力及對受損內(nèi)皮細胞的修復能力上，均較早期EPC有顯著提高。而關于兩類EPC亞型之間的關系及來源，目前各種報道觀點不一，甚至有觀點認為兩類EPC是由兩種不同細胞分化而來[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的細胞先后出現(xiàn)了早期及晚期EPC的細胞形態(tài)，該現(xiàn)象提示我們：晚期EPC很可能是由早期EPC演化而來，而并不是一類單獨的細胞來源。

EPC的鑒定目前仍然缺乏獲得廣泛公認的“金標準”。根據(jù)目前已有文獻報道和研究所普遍采用的鑒定方法，認為EPC的鑒定應包括細胞形態(tài)學鑒定、細胞表面抗原鑒定及細胞功能測定。EPC的早期及晚期的形態(tài)學特征差異較大。值得注意的是，我們在培養(yǎng)過程中，多次發(fā)現(xiàn)細胞生長出現(xiàn)極性排列現(xiàn)象，特別是出現(xiàn)細胞首尾相接并呈現(xiàn)管狀生長，以及由一個大的細胞集落生發(fā)出網(wǎng)狀排列細胞的生長現(xiàn)象。這些現(xiàn)象在其他細胞培養(yǎng)中尚屬少見，更加強烈地顯示出EPC作為血管內(nèi)皮細胞的成血管特性。同時，我們還發(fā)現(xiàn)：EPC的增殖能力極強，特別是生長至2周左右之后，其增殖加速現(xiàn)象格外明顯，提示EPC具有遲發(fā)型高增殖能力。有報道表明，EPC的增殖能力是內(nèi)皮細胞增殖能力的50倍左右[20]。關于EPC的細胞表面標志的鑒定標準，目前各家觀點不一。根據(jù)Asahara等的首次報道，認為EPC應同時表達CD34、CD133及VEGFR2。早期EPC還表達白細胞通用抗原CD45。但隨著研究的不斷深入，目前觀點認為，EPC的細胞表面標志是一個動態(tài)變化過程，隨著EPC向內(nèi)皮細胞逐漸分化，干細胞標志物CD133及白細胞標志物CD45表達會逐漸降低以致丟失。由于EPC是由造血干細胞分化而來，目前觀點認為，EPC應至少表達一個造血干細胞標記物CD34及反應內(nèi)皮細胞特征的細胞標記物VEGFR2或CD31[16]。而Schmidt- lucke等提出的鑒定外周血中EPC的流式細胞鑒定方法也將CD45弱陽性、CD34、VEGFR2雙陽性作為定義EPC的檢測標準[8]。在本次研究中，我們也選用CD34與VEGFR2雙陽性表達鑒定培養(yǎng)獲得的EPC。根據(jù)免疫熒光及流式細胞儀檢測結果，超過85%的細胞共表達上述兩抗原。提示所培養(yǎng)細胞確為EPC。關于EPC功能的檢測，目前主流的檢測方法為測定EPC吞噬乙?；兔芏戎鞍准敖Y合荊豆凝集素能力。該檢測方法曾被廣泛采用，甚至有研究僅使用該方法進行EPC鑒定[21]。隨著對EPC研究的發(fā)展及認識的深入，科研工作者發(fā)現(xiàn)，該功能并非EPC所特有，其他細胞如內(nèi)皮細胞也具有此類功能。因此，該檢測方法只能作為EPC鑒定的輔助手段，而完全依賴該方法進行EPC鑒定顯然不夠嚴謹。

綜上所述，通過本項研究，我們確立了一套自通過分離小鼠骨髓單核細胞進行EPC誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。并通過細胞形態(tài)學觀察、細胞表面抗原測定及細胞功能檢測3方面確定我們所培養(yǎng)的細胞為EPC,為今后利用EPC進行相關科學研究奠定了基礎。

[1] 張鐵須，周建中.內(nèi)皮祖細胞與高血壓病[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2008,36(2):141- 144．

[2] ASAHARA T,MUROHARA T,SULLIVAN A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964- 967.

[3] JI A L,TAKAHASHI M,YOSHIOKA T,et al.Therapeutic potential of endothelial progenitor cells for cardiovascular diseases[J].Curr Vasc Pharmacol ,2006,4(1):59- 65.

[4] STELLOS K,BIGALKE B,LANGER H,et al.Expression of stromal- cell- derived factor- 1 on circulating platelets is increased in patients with acute coronary syndrome and correlates with the number of CD34+progenitor cells[J].Eur Heart J,2009,30(5):584- 593.

[5] HU C H,WU G F,WANG X Q,et al.Transplanted human umbilical cord blood mononuclear cells improve left ventricular function through angiogenesis in myocardial infarction[J].Chinese Med J,2006,119(18):1499- 1506.

[6] DEVANESAN A J,LAUGHLAN K A,GIRN H R,et al.Endothelial progenitor cells as a therapeutic option in peripheral arterial disease[J].Eur J Vas Endovasc,2009,38(4):475- 481.

[7] IWAGURO H,YAMAGUCHI J,KALKA C,et al.Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration[J].Circulation,2002,105(6):732- 738.

[8] SCHMIDT- LUCKE C,FICHTLSCHERER S,Aicher A,et al.Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol[J].PloS One,2010,5(11):e13790.

[9] FADINI G P,SARTORE S,BAESSO I,et al.Endothelial progenitor cells and the diabetic paradox[J].Diabetes Care,2006,29(3):714- 716.

[10] di STEFANO R,BARSOTTI M C,FELICE F,et al.Smoking and endothelial progenitor cells:a revision of literature[J].Cur Pharm Design ,2010,16(23):2559- 2566.

[11] WERNER N,WASSMANN S,AHLERS P,et al.Endothelial progenitor cells correlate with endothelial function in patients with coronary artery disease[J].Basic Res Cardiol,2007,102(6):565- 571.

[12] BONELLO L,BASIRE A,SABATIER F,et al.Endothelial injury induced by coronary angioplasty triggers mobilization of endothelial progenitor cells in patients with stable coronary artery disease[J].J Thromb Haemost,2006,4(5):979- 981.

[13] YAMADA M,KUBO H,ISHIZAWA K,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia:evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair[J].Thorax,2005,60(5):410- 413.

[14] EGGERMANN J,KLICHE S,JARMY G,et al.Endothelial progenitor cell culture and differentiationinvitro:a methodological comparison using human umbilical cord blood[J].Cardiovasc Res,2003,58(2):478- 486.

[15] LIN Y,WEISDORF D J,SOLOVEY A,et al.Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].J Clin Invest,2000,105(1):71- 77.

[16] YODER M C,MEAD L E,PRATER D,et al.Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals[J].Blood,2007,109(5):1801- 1809.

[17] PRATER D N,CASE J,INGRAM D A,et al.Working hypothesis to redefine endothelial progenitor cells[J].Leukemia,2007,21(6):1141- 1149.

[18] HUR J,YOON C H,KIM H S,et al.Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis[J].Arterioscl Throm Vas,2004,24(2):288- 293.

[19] FADINI G P,BAESSO I,ALBIERO M,et al.Technical notes on endothelial progenitor cells:ways to escape from the knowledge plateau[J].Atherosclerosis,2008,197(2):496- 503.

[20] RAE P C,KELLY R D,EGGINTON S,et al.Angiogenic potential of endothelial progenitor cells and embryonic stem cells[J].Vascular Cell,2011,3:11.

[21] THOMAS R A,PIETRZAK D C,SCICCHITANO M S,et al.Detection and characterization of circulating endothelial progenitor cells in normal rat blood[J].J Pharmacol Toxicol.2009,60(3):263- 274．