小鼠同種異體內皮祖細胞移植治療急性肺損傷的相關研究

胡若愚，承燕，李好，張雷，景華，吳海衛(wèi)

(南京大學臨床學院,南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 心胸外科，江蘇 南京 210002)

急性肺損傷(acute lung injury， ALI)與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)廣泛存在于各種嚴重臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過程中[1]。目前認為，在ALI的發(fā)病初期，肺組織損傷的主要病理表現(xiàn)是肺血管內皮細胞破壞以及炎癥細胞浸潤。由于肺泡-毛細血管所構成的氣血屏障受破壞，導致肺血管通透性的增加，使得大量組織液攜帶各種炎癥細胞及炎癥因子進入肺間質及肺泡中，并隨之引發(fā)肺水腫；肺水腫又進一步加重了氧氣彌散障礙并增加死腔通氣量，從而導致了組織缺氧,并引起機體進一步的損傷[2- 3]。自1967年Ashbaugh等首次提出ARDS的概念后，醫(yī)學工作者嘗試使用了各種藥物治療該疾病，然而治療效果仍不盡如人意[4]。

自Asahara等[5]首次報道發(fā)現(xiàn)外源性內皮祖細胞(EPC)以來，不斷有研究揭示了EPC作為內皮細胞的前體細胞在血管新生及內皮修復中所發(fā)揮的重要作用。EPC多存在于骨髓中，并可被多種細胞因子、藥物、缺血及損傷信號動員進入血液循環(huán)，參與受損組織的內皮修復及血管新生[6]。研究表明：EPC在治療肢體缺血、心肌缺血、腎臟疾病及移植血管成活等方面均有重要而獨到的作用[7- 11]。研究顯示：EPC作為一種機體自身修復途徑，通過遷移、黏附于血管受損部位，替代受損內皮細胞或通過其旁分泌作用產生新的細胞因子而促進內皮再生，在維持機體血管內皮修復及更新過程中發(fā)揮重要作用。不僅如此，EPC在ALI的治療中也顯示其獨特的作用。Burnham等研究了ALI患者預后與循環(huán)血中EPC數量之間的關系，發(fā)現(xiàn)ALI/ARDS患者循環(huán)中的EPC數量增加，EPC數量高的患者預后好；同時，外周血EPC的數量可以反映炎癥相關性肺損傷血管損傷的程度，并可作為評價疾病預后的指標之一[12]。根據上述研究結果，我們推測：外周血循環(huán)中的EPC數量決定了肺血管損傷后肺血管內皮的修復的速度及水平，并直接影響疾病的進展和預后。然而，由于生理狀態(tài)下，外周血循環(huán)中EPC含量極低，僅占外周血單核細胞總量的0.002%[13]，因此，進行EPC移植治療是迅速提高外周血循環(huán)中EPC水平直接而有效的途徑。

本研究中，我們以轉基因EGFP- BALB/c小鼠作為細胞供體，自骨髓單核細胞分離、培養(yǎng)獲得EGFP- EPC，并在體外大量擴增后，回輸至由內毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導的野生型BALB/c小鼠ALI模型體內。試圖通過外源性EPC移植治療加速ALI小鼠肺血管損傷修復進程，改善其預后。同時應用熒光顯微鏡觀察輸入的外源性EGFP- EPCs在受體鼠體內遷移及歸巢情況,并通過組織病理學檢查、肺組織濕干重比、肺組織微血管再生情況等檢測手段，綜合評價外源性EPC移植對ALI的治療效果，為臨床使用EPC治療ALI提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及主要儀器

野生型BALB/c小鼠18只，雄性， 5～7周齡，體重21～25 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，恒溫、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，不限食水。轉基因EGFP- BALB/c小鼠30只，雄性，5～7周齡，體重18～23 g，與所用的野生型BALB/c小鼠屬同一祖系，平行傳代，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，恒溫、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，不限食水。LPS(Escherichia coli O55:B5，美國Sigma- Aldrich公司)，人纖維連接蛋白(美國R&D公司)，小鼠淋巴細胞分離液(美國Sigma- Aldrich公司)，大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(ab815，英國Abcam公司)，羊抗大鼠IgG- FITC抗體(sc- 2011，美國Santa Cruz公司)，超凈工作臺(蘇凈集團)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分離與培養(yǎng)

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉并處死后于75%酒精中浸泡30 min。于超凈工作臺上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離并取出，以1 ml注射器吸取PBS沖洗小鼠脛、股骨骨髓腔，密度梯度離心法獲得骨髓單個核細胞，細胞計數后，以5×106·孔-1細胞量將細胞接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔內加EGM- 2 Single Qutos培養(yǎng)液2 ml。將細胞置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞接種后第4天首次更換細胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞，將貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。此后每2 d更換培養(yǎng)液1次。細胞培養(yǎng)3周，每日觀察細胞生長狀態(tài)，并拍照留存。

1.3 ALI小鼠模型制作及分組

野生型BALB/c小鼠行戊巴比妥腹腔注射麻醉，頸部脫毛并以75%酒精消毒術野。于小鼠頸部正中行長約0.5 cm切口。鈍性分離小鼠頸部肌肉，暴露氣管。以1 ml注射器吸取預先配制好的LPS溶液50 μl，經小鼠氣管內滴注。滴注時，抬高操作臺成45°角，使LPS溶液順氣管流入小鼠肺部。滴注后，將小鼠直立并旋轉，使LPS在肺內盡量均勻分布。其后以絲線縫合小鼠頸部切口。受體BALB/c雄性小鼠共18只，隨機分為3組，每組6只。分別為：假手術組 (經氣管內滴注50 μl PBS，其后30 min經尾靜脈注射100 μl PBS)、ALI組(經氣管內滴注5 mg·kg-1LPS，體積為50μl，30 min后經尾靜脈注射100 μl PBS)、EPC治療組(經氣管內滴注5 mg·kg-1LPS，體積為50 μl，30 min后根據受體小鼠體重經尾靜脈注射EGFP- EPCs細胞懸液，注射細胞量為5×104·g-1)。各組小鼠均飼養(yǎng)至術后3 d處死，留取肺組織標本。

1.4 移植受體小鼠肺組織中外源性EPC的表達

迅速打開處死后BALB/c小鼠的胸腔，摘取左上肺,以OCT包埋小鼠肺組織，置于冰凍切片機中-18 ℃速凍后行5 μm切片，并迅速于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 移植受體小鼠肺損傷程度評估

1.5.1 肺組織病理切片觀察及肺損傷評分 BALB/c小鼠處死后，迅速摘取其左下肺組織，中性福爾馬林固定，石蠟包埋、脫水后切片，行蘇木素- 伊紅染色，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察并拍攝照片。將各組小鼠肺組織HE切片與光學顯微鏡下觀察并行雙盲評分。評分指標包括肺泡組織結構、肺間質及肺泡內出血情況、肺間質及肺泡內炎癥細胞浸潤情況、肺泡內透明膜形成程度。4項指標以0～4分進行半定量分析，累積評分為該切片肺損傷指數評分。

1.5.2 肺組織濕干重終比測定 實驗動物分組及動物模型制作方法同前。預先留取的小鼠右側肺組織，以微量天平稱量小鼠右肺質量。此后將肺組織放入烘箱內50 ℃烘焙24 h取出。再次稱量小鼠肺干重。小鼠肺部濕干重比計算方法為：濕干重比=(肺濕重-肺干重)/肺干重×100%。

1.5.3 移植受體小鼠肺組織新生微血管密度(MVD)測定 以CD34為新生血管標記物。將移植受體小鼠肺組織行石蠟切片后進行CD34免疫組化染色，細胞棕褐色染色為CD34表達陽性。各組BALB/c小鼠中，每組隨機選取4個樣本，每只小鼠對應免疫組化染色切片選取2張。先于低倍鏡下選取CD34表達陽性率最高部位作為檢測部位,然后光鏡400倍選取該區(qū)域5個視野拍攝。統(tǒng)計每張照片1 mm2區(qū)域中CD34陽性染色的微血管數量，其平均值為該組小鼠肺組織切片所對應的MVD值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 EGFP- EPCs的培養(yǎng)

EGFP- EPCs分離、培養(yǎng)方法與自野生型BALB/c小鼠骨髓單核細胞分離、培養(yǎng)EPCs方法完全相同。在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)，所培養(yǎng)的EGFP- EPCs生長、增殖能力與普通EPCs相同，細胞早期呈集落樣生長狀態(tài)(圖1A)，細胞培養(yǎng)至3周后，細胞生長呈現(xiàn)鋪路石樣狀態(tài)(圖1B)。

圖1EGFP-EPCs熒光顯微鏡下照片A.早期EGFP- EPC呈集落樣生長狀態(tài);B.晚期EGFP- EPCs于熒光顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長

Fig1EGFP-EPCsobservedunderfluorescentmicros-copeA.Early EGFP- EPCs exhibited a colony- forming appearance;B.Late EGFP- EPCs exhibited a cobblestone- like appearance

2.2 肺組織冰凍切片觀察細胞移植受體小鼠肺組織中外源性輸入EGFP- EPC

熒光顯微鏡下觀察各組受體小鼠肺組織冰凍切片中輸入的EGFP- EPCs熒光表達情況。發(fā)現(xiàn)接受外源性EGFP- EPCs治療的熒光小鼠組肺組織冰凍切片內肺血管內壁上附著有明顯的綠色熒光層(圖2A)。而假手術組(圖2B)及ALI組(圖2C)中則無法觀測到明顯的綠色熒光表達。該結果提示：外源性輸入的EGFP- EPCs可隨血液循環(huán)定向遷移至受損肺血管內皮部位，與之黏附從而發(fā)揮內皮治療作用。

2.3 各組小鼠肺組織HE切片檢查及各組肺損傷評分結果

HE切片顯示：假手術組肺泡結構完整，肺泡腔及肺間質內未見明顯炎癥細胞浸潤、出血及透明膜形成征象(圖3A)。LPS可致嚴重的肺組織損傷，表現(xiàn)為肺泡結構的破壞、肺泡腔減小、肺泡腔及肺間質內出血、炎癥細胞浸潤、肺泡透明膜形成等(圖3B)。EPC治療組的肺組織病理切片較之ALI對照組損傷程度明顯減輕，肺泡結構基本維持，炎癥細胞浸潤及肺組織充血程度也有明顯降低(圖3C)。肺損傷指數評分顯示：LPS誘導的ALI明顯增加了肺組織損傷指數評分，差異有統(tǒng)計學意義(10.83±1.17vs1.17±0.98，P<0.001)，EPC治療組肺損傷程度顯著降低(7.67±1.21vs10.83±1.17，P=0.003)，但較假手術組仍明顯增高(7.67±1.21vs1.17±0.98，P<0.001)(圖4)。

圖2EPC治療組(A)、假手術組(B)、ALI組(C)肺組織冰凍切片于熒光顯微鏡下照片箭頭所指為肺血管內膜上明顯的綠色熒光信號，提示移植的EGFP- EPC細胞可定向黏附于受損的肺血管內膜表面

Fig2LungtissuefrozensectionsfromEPCgroup(A),shamgroup(B),ALIgroup(C)

圖3各組小鼠肺組織HE染色切片A.假手術組;B.ALI組;C.EPC組

Fig3HEstainingoflungtissuesA.Sham group;B.ALI group;C.EPC treatment group

圖4肺損傷指數評分與假手術組比較，aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig4DeterminationoflunginjuryscoresCompared with the sham group， aP<0.01; compared with ALI group，bP<0.01

2.4 各組小鼠肺濕干重比測定

肺濕干重比ALI組較假手術組明顯增高 [(72.17±5.98)%vs(23.00±3.74)%，P<0.001]。而EPC治療組較ALI組明顯降低(61.67±6.25%vs72.17±5.98%，P<0.05)，但仍明顯高于假手術組 (61.67±6.25%vs23.00±3.74%，P<0.001)(圖5)。

圖5肺組織濕干重比測定與假手術組比較，aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig5DeterminationoflungwettodryratioCompared with the sham group,aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

2.5 移植受體小鼠肺組織MVD測定

假手術組與ALI組比較，新生血管的MVD值極低，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而EPC治療組新生血管密度明顯增加，與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6)。

圖6CD34免疫組化染色肺MVD測定與假手術組比較, aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig6DeterminationofCD34immunostainingMVDCompared with the sham group，aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

3 討 論

肺血管內皮損傷是ALI/ARDS發(fā)病的始動因素[14]，如能在ALI發(fā)病早期對受損的肺血管內皮進行快速而有效的修復，則可以從源頭上阻止疾病的進一步發(fā)展,從而提高治愈率。隨著對ALI/ARDS研究的不斷深入以及干細胞治療技術的興起，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，EPC細胞治療作為一種全新的治療方法，可能是ALI/ARDS治療的新思路[15- 16]。EPC主要存在于人體骨髓中，在損傷、缺氧、細胞因子以及藥物等作用因素的動員下進入血液循環(huán)，并有著向受損器官及組織定向遷移的特性。研究表明，EPC不僅能夠以“嵌合”的方式直接參加受損血管部位內皮損傷修復，替代壞死或凋亡的內皮細胞，還能夠發(fā)揮旁分泌作用，促進內皮損傷的修復和血管的新生[17- 19]。而更有研究表明，體內EPC的水平與ALI/ARDS的病程進展及預后密切相關。Burnham與Yamada均研究了外周血中EPC水平及集落形成能力與患者ALI/ARDS預后的相關性，并得出了一致的結論。他們的研究認為：ARDS發(fā)生時，如果內體內EPC水平過低或活力低下，往往預后不佳。因此，EPC 已成為反映ALI血管損傷程度的指標之一，同時也是對炎癥預后判斷的重要預警指標[20- 22]。對于上述現(xiàn)象，Denburg等[23]提出，炎癥反應時釋放的炎癥介質及多種未知因素動員骨髓的EPC 進入外周循環(huán)感知損傷，并通過動員和遷移到達受損部位，修復血管內皮，形成新生血管，恢復局部血流，促進組織結構和功能的修復。然而，在生理狀態(tài)下EPC的水平極低，一旦機體遭受重大打擊，體內的EPC往往不能及時滿足機體血管損傷修復的需要。因此，EPC移植作為利用EPC治療疾病的有效手段，被人們逐漸認識和重視。

近幾年，已有學者開始嘗試通過自體EPC體外擴增后回輸至ALI動物模型體內進行ALI/ARDS治療，并已取得明顯的治療效果[24- 25]。但從臨床實用角度考慮，自體細胞回輸往往不符合臨床實際工作需要：由于ALI/ARDS發(fā)病的突然性，患者很少有機會預留干細胞以備臨床治療之需。而EPC抗原性相對較弱，機體排斥反應較輕，因此，同種異體EPC移植可能是更為有效并切合臨床實際工作需要的治療方法。與此同時，人們發(fā)現(xiàn)EPC至少存在2種細胞亞型：早期EPC和晚期EPC。在細胞的生長、增殖、成血管能力等方面，晚期EPC均明顯優(yōu)于早期EPC。因此，晚期EPC被認為具有更加廣泛和美好的治療前景[26]。然而，由于對晚期EPC的研究和報道相對較晚，目前尚未見有明確使用晚期EPC治療ALI/ARDS的研究報道。本研究使用培養(yǎng)超過3周的晚期EPC作為移植細胞治療ALI/ARDS，在細胞體外擴增、培養(yǎng)的過程中，細胞生長方式呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣生長排列，且細胞增殖速度較早期EPC明顯加快，符合晚期EPC的生長特點。實驗結果表明：使用這種晚期EPC進行細胞移植治療，能夠明顯改善LPS所誘導的肺組織損傷，維持肺血管內皮的完整性，減少肺泡結構的破壞以及炎癥因子向肺間質和肺泡內的聚集。

為了有效地對輸入體內的外源性內皮祖細胞進行細胞示蹤，我們選用了轉基因EGFP- BALB/c小鼠作為細胞供體。該種型小鼠基因中含有EGFP基因，其有核細胞均表達EGFP蛋白，于熒光顯微鏡下發(fā)出耀眼的綠色熒光，信號強度高且穩(wěn)定，并可完全避免細胞標記過程中對細胞活性的損傷。此外，由于EGFP基因在EGFP- EPC中穩(wěn)定表達，不受細胞增殖及分化的影響，因此，能夠更全面、客觀地反映出外源性細胞在體內的增殖及分化情況。我們的研究表明：外源性輸入的EGFP- EPCs能夠在肺血管內大量定植，并黏附于血管壁內膜上，反映出輸入體內的外源性EPC向受損組織及器官趨化的特性。CD34免疫組化染色多用于反映組織內新生血管的情況。在本研究中，通過使用CD34抗體標記的肺組織切片觀察，并統(tǒng)計單位面積內陽性標記的微血管數量，我們發(fā)現(xiàn)：無論是假手術組還是ALI組，其肺組織上CD34的表達均極低，而進行細胞移植的受體鼠肺組織切片上，可看到明顯的陽性標記，差異顯著。該現(xiàn)象從側面提示我們：在機體遭受重大打擊時，自身骨髓的EPC動員是非常有限的，往往不能夠滿足急性打擊下機體自身修復的需要，因此更凸顯出外源性EPC移植在ALI/ARDS這種突發(fā)打擊下迅速提高血循環(huán)內EPC水平、滿足機體修復需要的重要而獨特的優(yōu)勢。

綜上所述,使用外源性EPC移植治療ALI/ARDS，能夠有效地修復受損肺血管內皮細胞，維持肺泡- 毛細血管氣血屏障的完整性，減少炎癥細胞及炎癥因子向肺間質及肺泡內浸潤，從而加速受損肺組織內的內皮修復及血管新生，并最終減輕肺損傷。

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