小鼠過敏性哮喘模型制備的特點分析

馬子風，尹磊淼，冉君，王宇，徐玉東，管楠，楊永清

(上海中醫藥大學 上海市針灸經絡研究所，上海 200030)

過敏性哮喘(簡稱哮喘)發病率逐年升高，嚴重影響人類健康[1]，已成為全球性社會衛生問題[2]。哮喘發病機制復雜[3]，疾病動物模型作為生命科學研究的重要支撐條件極大地促進了對哮喘病理生理機制的理解[4]。作為最常用的免疫研究工具，小鼠哮喘模型可模擬人類哮喘的速發相及遲發相反應、變態反應性炎癥以及氣道重塑特征，并在哮喘發病機制的相關分子研究中發揮著重要作用[5]。

目前小鼠哮喘模型已廣泛應用在變應性哮喘、感染性哮喘、運動性哮喘、壓力性哮喘、心理應激哮喘以及職業性哮喘等研究方面。根據不同類型研究的需要，模型制作方法不盡相同。在小鼠哮喘模型的制作過程中，小鼠品系、致敏及激發方法多種多樣。因此弄清小鼠哮喘模型制備方法與模型特點的聯系，根據實驗目的選擇實驗所需的模型，合理選擇小鼠品系、過敏原及制作方案，是哮喘科研工作的首要任務。

1 常用小鼠品系

從20世紀60年代起，小鼠就開始應用在哮喘研究領域。作為目前最常用的實驗模型，有200多個近交系可供挑選，常用的有BALB/c、C57BL/6、129Sv、A/J等。以哮喘和小鼠為主題詞檢索近10年PubMed數據庫中所有關于哮喘和小鼠的文章，結果顯示從2003年9月1日至2013年9月1日采用小鼠制作哮喘模型的文獻約有14 814篇，其中使用BALB/c和C57BL/6制作哮喘模型比例分別占33.04%和23.75%，BALB/c使用頻率約為C57BL/6的1.4倍(圖1)。

圖1近10年PubMed數據庫中采用各品系小鼠制作哮喘模型情況

Fig1ApplicationofvariousstrainsofmiceforasthmamodelinPubMeddatabaseduringthelastdecade

不同品系小鼠對致敏原敏感性不同，且抗原激發后過敏性炎癥表現不同(表 1)。在對不同致敏原反應表現上C57BL/6小鼠對塵螨和豚草抗原反應性較強；A/J小鼠對塵螨反應性遠高于卵白蛋白(ovalbumin，OVA)[6];129Sv對OVA以及呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)反應性更強[7]，表現出明顯的Th2型免疫反應并出現肺內嗜酸粒細胞浸潤；BALB/c小鼠較易產生針對OVA和花粉的氣道高反應性[8]，但容易對長期單一致敏原的霧化攻擊產生耐受，從而降低炎癥和氣道高反應性表現[9]。

表1不同品系小鼠對常見致敏原的敏感性表現

Tab1Susceptibilityofdifferentstrainsofmicesensitizedbycommonallergens

致敏原BALB/cC57BL/6129SvA/JOVA++++++++++塵螨+++++/+++病毒++++/花粉+++++/++蟑螂++/+

注：+為出現，++為強烈，+++為劇烈，/為未報道

Note:+appear，++intense，+++severe，/unreported

在抗原致敏及激發后過敏性炎癥表現上BALB/c、C57BL/6和129Sv致敏后均可產生相應的IgE抗體，但BALB/c小鼠總IgE量比后兩者少而特異性IgE量更多[10]，也有研究表明該模型可能存在非IgE依賴性哮喘通路[6]。BALB/c小鼠較易出現強烈的Th2型細胞因子免疫反應，能產生廣泛肺嗜酸粒細胞浸潤[11]。C57BL/6小鼠致敏后產生的氣道高反應性被認為和嗜酸粒細胞血癥有關[12]。

目前研究認為氣道高反應性以及激發后氣道阻塞表現和基因相關度很高，而A/J小鼠在這方面表現比BALB/c、C57BL/6和129Sv更具有優勢[13]，可能與白介素- 4(IL- 4)受體基因多態性有關[14]。在采用滴鼻激發制作的氣道高反應性哮喘模型中，BALB/c、C57BL/6、129Sv對乙酰甲膽堿反應性遠不如A/J，但若改用霧化激發則結果又完全相反[15]，由此可見哮喘模型病理表現與制作方法相關性很高。

2 小鼠哮喘模型的致敏

致敏方法能夠影響宿主小鼠的免疫反應，因此，合理地選擇一種模型需要綜合考慮致敏原和佐劑的類型、致敏方式以及致敏劑量。

2.1 常見致敏原

目前常用致敏原主要有OVA、塵螨、病毒、花粉、蟑螂變應原等。

作為經典的抗原，OVA具有免疫原性強、易于獲得、相關試劑選擇空間大等優勢，常與非免疫原性佐劑聯合使用。用OVA聯合氫氧化鋁腹腔注射致敏129Sv小鼠，OVA生理鹽水溶液連續霧化激發后可得到以嗜酸粒細胞浸潤、氣道高反應性為主要表現的急性炎癥型哮喘模型[16]。采用OVA和硫酸鋁鉀腹腔注射致敏3次，1周后連續滴鼻3次激發可制作過敏性哮喘模型，表現出明顯的氣道高反應性[17]。

有文獻[18]報道，用塵螨比OVA制作的小鼠慢性哮喘模型表現出更持久的氣道高反應性。給予屋塵螨致敏BALB/c小鼠，第10天用屋塵螨滴鼻激發可制作以變態反應性炎癥為主要表現的過敏性哮喘模型[19]。給予屋塵螨滴鼻3～6周，每周3次可制作慢性過敏性哮喘模型，并且發現6周致敏后的總IgG1及IgE量高于3周致敏且氣道重塑表現更明顯[20]。持續給予屋塵螨滴鼻7周致敏BALB/c小鼠可制作氣道重塑模型，并出現明顯氣道嗜酸粒細胞炎癥和對乙酰甲膽堿的強烈氣道高反應性表現[18]。雖然近年塵螨造模應用增多，但塵螨不易提純，增加了劑量掌握的難度，應用仍不及OVA廣泛。

RSV可作為抗原單獨致敏小鼠，也可聯合OVA用來制作重癥哮喘模型。采用紫外線滅活的RSV聯合氫氧化鋁皮下注射致敏小鼠，RSV滴鼻激發可制作以氣道黏膜下漿細胞及嗜酸粒細胞浸潤的哮喘模型[21]。而在OVA致敏的條件下，使用RSV誘導制作的急性病毒性哮喘模型比單純OVA或單純RSV致敏激發的哮喘模型病理變化更嚴重，表現出感染性炎癥和變態反應性炎癥特征[22]。在OVA致敏條件下RSV感染可加重氣道炎癥，導致氣道上皮的破壞增生，這可能是其增高氣道高反應性的機理之一[23]。

花粉是人類支氣管哮喘常見的過敏原，采用花粉致敏制作小鼠哮喘模型也能模擬哮喘實際發病情況[24]。有報道用柏樹花粉提取物聯合氫氧化鋁腹腔注射致敏2次，3周后滴鼻激發可制作出高濃度嗜酸粒細胞浸潤的變態反應性炎癥模型，并出現Th2型細胞因子增多[25]。用樺樹花粉提取物聯合氫氧化鋁腹腔注射致敏2次，3周后連續霧化4天激發可成功制作過敏性哮喘模型，出現強烈的氣道高反應性[26]。也有報道皮下注射橄欖花粉提取物和氫氧化鋁制作哮喘模型可表現出顯著Th2型免疫反應[24]。但由于花粉種類繁多，而且存在地域差別，采用花粉制作的哮喘模型也多樣，使模型的重復和相互間比較研究復雜化。

除了花粉，蟑螂也和哮喘發病有密切關系。常見的德國小蠊和美洲大蠊體內都存在多種潛在致敏原，有德國小蠊提取物Bla g2(失活天冬氨酸蛋白酶)、Bla g4(calycin)、Bla g 5(谷胱甘肽- S- 轉移酶)等，所以到目前為止國內和國際對蟑螂變應原所致哮喘都很難進行標準化研究[27- 28]。有報道示蟑螂提取物聯合弗氏完全佐劑腹腔注射致敏，第14天給予等量抗原液滴鼻激發，第20天氣管內給予蟑螂變應原可成功制作出顯著氣道高反應性表現的過敏性哮喘模型[29]。每隔4 d滴鼻給予蟑螂提取物和不完全弗氏佐劑共5次，氣管內給予蟑螂提取物2次激發可制作出重度氣道重塑表現的慢性過敏性哮喘模型[30]。

在眾多的哮喘模型中，不同致敏原基本都可以制作各種哮喘模型，但是每個致敏原也有自己本身的缺陷。比如單用OVA很難制作重癥哮喘模型，塵螨提純價格昂貴，病毒和真菌制作的哮喘模型雖為臨床中通過控制病原體感染而控制哮喘發生提供依據，但穩定性欠佳，其在誘導哮喘發生中的作用還需進一步闡明[31]。蟑螂變應原、花粉及職業性致敏原等由于種類繁多、模型制作很難標準化而使模型的復制復雜化，故在制作哮喘模型中使用相對較少。

2.2 佐劑

哮喘致敏時常需聯合佐劑使用。佐劑可通過特異性或非特異性免疫增強作用使機體產生更多的抗體量，不僅可以減輕免疫耐受，還能節約使用的抗原量[32]。在哮喘模型的制作中最常用的是鋁化合物以及來源于病原微生物的佐劑，以氫氧化鋁和滅活百日咳桿菌多見。

作為最常用的佐劑，氫氧化鋁不僅可以增強免疫反應，還可以增加Th2型細胞因子的產生[33]，甚至影響激發前后宿主免疫反應類型。使用劑量從1 mg到40 mg不等，最常用的劑量是2.25 mg。有報道示OVA聯合氫氧化鋁間隔7 d或者14 d的兩次致敏，可引起強烈Th2偏向的免疫反應并產生高濃度的特異性IgE含量[34]。有研究示使用氫氧化鋁佐劑聯合OVA制作的哮喘模型表現出非IgE和非肥大細胞依賴的過敏性炎癥和氣道高反應性，相反，不使用氫氧化鋁佐劑僅用OVA制作的哮喘模型則出現明顯的肥大細胞依賴性過敏性炎癥表現[35]。

關于百日咳桿菌佐劑，有報道比較采用單純百日咳桿菌、OVA聯合百日咳桿菌及單純OVA致敏小鼠制作哮喘模型，發現百日咳桿菌雖然可通過引起Th1型免疫反應調節Th2型免疫反應，但仍然可加重哮喘模型病理表現、氣道炎癥以及氣道高反應性[36]。

2.3 致敏方式及致敏原劑量

致敏方式在一定程度上影響小鼠免疫反應。致敏方式主要有腹腔注射、霧化吸入、皮下注射、鼻內給藥、氣管內給藥等,目前最常用的致敏方式是腹腔注射致敏原加佐劑。Secor等[37]用OVA聯合氫氧化鋁腹腔注射致敏C57BL/6小鼠，成功制作了急性過敏性哮喘模型。此外，僅用吸入致敏原的方式也可以成功制作過敏性哮喘模型。Larsen等[38]用霧化吸入OVA致敏BALB/c小鼠，每天20 min，連續10 d，制作了最短時間的氣道高反應性模型，并出現高濃度特異性IgE。此外，皮下多點注射、鼻內給藥及氣管內給藥等方式制作的哮喘模型也可達到實驗目的。Corry等[39]采用皮下注射OVA混合氫氧化鋁，制作了急性氣道高反應性模型。Johnson等[18]采用HDM滴鼻BALB/c小鼠7周，每周5次制作出有明顯氣道嗜酸粒細胞炎癥、對乙酰甲膽堿的強烈氣道高反應性表現的氣道重塑模型。采用屋塵螨氣管內給藥致敏BALB/c小鼠，可成功制作變態反應性炎癥表現的過敏性哮喘模型[19]。根據模型需要，也有多次致敏和單次致敏的區別。采用隔天腹腔注射粉塵螨聯合氫氧化鋁6次，可成功制作肺部變態反應性炎癥哮喘模型[40]。

在模型制作過程中，不同抗原劑量影響肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞數量、IgE含量、炎癥程度以及氣道高反應性表現[41]。在腹腔注射致敏制作的小鼠哮喘模型中，OVA致敏劑量通常在1～20000 μg，其中10～50 μg使用范圍較常見[34]。有報道采用0、10、100、1000 μg OVA分別致敏小鼠，發現10 μg組產生以IgE為主的特異性抗體，且脾細胞培養上清中Th2型細胞因子增加明顯，1 000 μg組產生以IgG2a為主的特異性抗體，Th1型細胞因子增多；而且氣道高反應性只在10 μg OVA致敏的小鼠模型中出現[42]。此外，用0、3、30、300μg·ml-1的屋塵螨連續霧化制作氣道高反應性小鼠模型，發現300μg·ml-1組出現氣道高反應性以及大量炎癥細胞浸潤，血清IgE升高，但3μg·ml-1和30μg·ml-1組僅出現氣道高反應性及血清IgE升高，并無氣道炎癥[43]。目前認為致敏原的劑量可能通過影響細胞因子的類型，從而影響動物模型表型的變化[44]。

3 小鼠哮喘模型的激發

模型的多樣性部分程度取決于激發的途徑、方法以及持續時間。激發方式常見的有霧化、鼻內給藥及氣管內給藥。其中霧化激發小鼠狀態較好，激發致死率低，使用最廣泛。

急性模型多采用連續4～8 d的霧化吸入激發，模型多可表現出嗜酸粒細胞浸潤及氣道高反應性。變態反應性炎癥哮喘模型制備中致敏和激發兩階段持續時間比較短，激發時間在兩周左右。抗原系統致敏及反復較長時間的同一抗原激發對小鼠氣道重塑模型的建立是必需的，抗原激發可持續亦可間斷進行，激發時間多超過3周[31](圖2)。

圖2小鼠哮喘模型制備過程激發時間與特征聯系

Fig2Relationshipbetweenchallengetimeandfeaturesinmurineasthmamodelpreparation

在探討不同激發方式對小鼠過敏性哮喘模型影響實驗中，采用同樣致敏方法3次滴鼻激發和3次霧化激發制作的哮喘模型都可以表現出明顯氣道炎癥、嗜酸粒細胞浸潤，但滴鼻激發建立的哮喘模型比霧化激發表現更顯著[45]。有報道示霧化激發比滴鼻激發更易產生氣道高反應性[46]。采用同樣致敏方法，氣管內給藥制作的哮喘模型表現出氣道及肺組織炎癥、杯狀細胞增生、上皮細胞增生以及輕度的上皮組織纖維化，而霧化激發建立的哮喘模型則出現明顯氣道高反應性并伴有顯著嗜酸粒細胞浸潤[15]。

4 總 結

綜上所述，小鼠哮喘模型制作方法多種多樣，在哮喘研究中提供了多種思路和方法，目前常用的變態反應性炎癥哮喘模型、氣道重塑模型、重癥哮喘模型等都在一定程度上模擬了人類哮喘的發生、發展過程(表2)。根據不同實驗需要選擇合適的小鼠品系及制作方案，尋找更加理想的研究平臺，為研究哮喘病理生理機制提供針對性依據仍然是當前的重點問題。

此外，小鼠哮喘模型的制備方法與模型的病理表現直接相關，所以系統的對比研究不同品系、不同致敏及激發方式與哮喘模型的聯系很有必要。隨著小鼠哮喘模型越來越廣泛的應用，造模方法、生物技術等將不斷完善，對小鼠哮喘模型進行客觀認識及評價，深入比較研究不同方法制作的小鼠哮喘模型的特征，將使得制備的小鼠哮喘模型更加貼近人類哮喘表現，在此基礎上進一步為哮喘的發病機制及治療提供依據。

表2 3類主要的小鼠哮喘模型特征與人類哮喘的特征區別

Tab2Thecharacteristicsthatdistinguishthreemainmurineasthmamodelswithhumanasthma

特征人類哮喘變態反應性炎癥哮喘模型氣道重塑模型重癥哮喘模型支氣管炎癥表現[34]+++++++-++嗜酸粒細胞性炎癥+++++++-+BALF中Th2細胞數量+++++++++對組胺的反應+---對白三烯的反應+---氣道高反應性[34]++-+肺組織慢性炎癥+++-++++++氣道上皮細胞改變++-+++氣道平滑肌增生+++-++++氣道重塑[34]+++-++++++

注：+為出現，++為強烈，+++為劇烈，++++為顯著，- 為不出現

Note:+appear，++intense，+++severe，++++marked，- not appear

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