高胰島素對不同糖濃度下視網膜色素上皮細胞活性氧表達的影響

施光明，欒潔

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫院 眼科，江蘇 南京 210009)

糖尿病患者因糖代謝障礙導致全身各組織器官的微血管發生病變，其中糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是其最嚴重的微血管并發癥之一，也是成年人致盲的重要原因之一[1]。胰島素注射被認為是控制血糖并減少糖尿病并發癥的較好的手段，但有臨床研究觀察到使用大劑量胰島素控制血糖后出現DR惡化的現象，這引起了我們的關注。為探討其中可能的機制，我們觀察了高濃度胰島素對不同糖濃度下體外培養的視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium， RPE)細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人RPE細胞(cultured human retinal pigment epithelial cells-19， ARPE-19，購自ATCC公司)、DMEM/F12培養液(Gibco公司)、胰島素(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司)、胎牛血清(FCS，杭州四季青)、0.05% Trypsin- EDTA(Gibco公司)、流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2 方法

ARPE- 19懸液置于含有10% FCS的DMEM/F12培養液的培養瓶內，于37℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至融合后用0.05% Trypsin- EDTA消化，離心，制成單細胞懸液，按1∶4～ 1∶6傳代。將長至融合狀態的細胞以0.05% Trypsin- EDTA消化，離心，制成單細胞懸液。接種細胞懸液于25cm2的培養瓶，置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養，細胞融合后隨機分成空白對照組(葡萄糖5.6mmol·L-1)、高胰島素組(葡萄糖5.6mmol·L-1+胰島素104U·L-1)、高糖組(葡萄糖30mmol·L-1)、高胰島素+高糖組(葡萄糖30 mmol·L-1+胰島素104U·L-1)4組；空白對照組采用24.4mmol·L-1甘露醇平衡滲透壓差別；按分組分別在5.6、30mmol·L-1葡萄糖濃度下培養3d，無血清培養液培養12h。再按分組給予104U·L-1胰島素干預24h。

1.3 細胞內ROS產生的檢測

以2′，7′- 二氯熒光素二乙酸酯(DCFH- DA)法檢測RPE細胞中ROS的水平，應用ROS檢測試劑盒按照說明書流程操作。流式細胞儀計數50000個細胞(波長488nm)檢測平均熒光強度，以反映細胞內ROS水平。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計學處理，采用配對t檢驗分析高濃度胰島素、高濃度糖及兩者共同作用對RPE細胞ROS的影響，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

如圖1、2所示，空白對照組、高胰島素組、高糖組、高胰島素+高糖組各組均顯示有RPE細胞內ROS的表達，高胰島素組、高糖組、高胰島素+高糖組ROS的產生量均明顯多于空白對照組，分別是空白對照組的1.47、1.35、1.86倍，差異均具有統計學意義(t=24.0、4.203、19.562、P<0.05)，高胰島素+高糖組RPE細胞ROS產量分別是高胰島素組、高糖組的1.27和1.38倍，差異均有統計學意義(t=10.090、4.028；P<0.05)；高胰島素組與高糖組相比，t=1.285，P>0.05，差異無統計學意義。

圖1各濃度組ROS的相對表達量

A

B

C

D

A.空白對照組;B.高胰島素組;C.高糖組;D.高胰島素+高糖組

圖2各組ROS表達量

3 結 論

隨著我國糖尿病患者的增多，DR患者致盲也呈上升趨勢，其發病率隨著病程的延長而增加。研究發現，大約一半以上的糖尿病患者在患病5～10年后會發生眼底病變，15年后則高達75%～80%，其中嚴重危害性的增生性DR占25%[2]。關于DR發生的機制一直是臨床和科研工作者研究關注的熱點，Brownlee[3]提出的糖尿病并發癥發生的統一機制學說認為，經典的多元醇途徑、糖基化終末產物(AGEs)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑和氨基己糖途徑均是在高糖環境下，線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導致的結果。有研究[4]認為，2型糖尿病并發癥的發生還與炎癥及胰島素抵抗有密切聯系。

胰島素是由胰島β細胞分泌，是機體內唯一降低血糖的激素，胰島素注射被認為是控制血糖并減少糖尿病并發癥的較好手段，但有臨床研究發現，胰島素強化治療會引起DR的惡化[5]。

我們的前期試驗證實，高濃度糖條件下培養ARPE- 19可致細胞損傷，抑制增殖，并使ROS生成增加[6]。本次實驗也再次證實了這點，高糖組產生的ROS量顯著高于空白對照組，高胰島素組產生的ROS量也顯著高于空白對照組，說明高胰島素也能引起RPE細胞中ROS的產生增加。而當高濃度胰島素作用于高濃度糖條件下培養的RPE細胞時，ROS的產生量明顯高于高濃度糖和高濃度胰島素分別單獨作用于RPE細胞時ROS的產生量，提示高濃度胰島素與高濃度糖對RPE細胞的氧化損傷可以產生協同作用，這可能就是糖尿病患者行胰島素強化治療時引起DR惡化的機制之一。

[1] MORLEY J E.Diabetes and aging:epidemiologic over view[J].Clin geriatr Med,2008,24(3):395- 405．

[2] BHADURI G,BANDYOPADHYAY M.Challenges to confront diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity[J].J Indian Med Assoc,2005,103:363- 367．

[3] BROWNLEE M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature,2001,414:813- 820．

[4] 朱亭,鄧月珍,葉飛,等.吡格列酮對肥胖2型糖尿病患者炎癥因子的影響[J].現代醫學,2013,41(1):23- 25．

[5] The Diabetes Control and Complications Trial.The effect of intensive diabeies treatment on the progession of diabetic retinopathy in insulin- dependent diabetes mellitus[J].Arch Ophthalmol,1995,113(1):36- 51．

[6] 馮麗麗,欒潔,傅敏,等.高糖體外對視網膜色素上皮增生以及活性氧表達的影響[J].國際眼科雜志,2010(3):453- 455．