高胰島素對不同糖濃度下視網(wǎng)膜色素上皮細胞活性氧表達的影響

施光明，欒潔

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 眼科，江蘇 南京 210009)

糖尿病患者因糖代謝障礙導(dǎo)致全身各組織器官的微血管發(fā)生病變，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是其最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是成年人致盲的重要原因之一[1]。胰島素注射被認(rèn)為是控制血糖并減少糖尿病并發(fā)癥的較好的手段，但有臨床研究觀察到使用大劑量胰島素控制血糖后出現(xiàn)DR惡化的現(xiàn)象，這引起了我們的關(guān)注。為探討其中可能的機制，我們觀察了高濃度胰島素對不同糖濃度下體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium， RPE)細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人RPE細胞(cultured human retinal pigment epithelial cells-19， ARPE-19，購自ATCC公司)、DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)、胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)、胎牛血清(FCS，杭州四季青)、0.05% Trypsin- EDTA(Gibco公司)、流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

1.2 方法

ARPE- 19懸液置于含有10% FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞長至融合后用0.05% Trypsin- EDTA消化，離心，制成單細胞懸液，按1∶4～ 1∶6傳代。將長至融合狀態(tài)的細胞以0.05% Trypsin- EDTA消化，離心，制成單細胞懸液。接種細胞懸液于25cm2的培養(yǎng)瓶，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合后隨機分成空白對照組(葡萄糖5.6mmol·L-1)、高胰島素組(葡萄糖5.6mmol·L-1+胰島素104U·L-1)、高糖組(葡萄糖30mmol·L-1)、高胰島素+高糖組(葡萄糖30 mmol·L-1+胰島素104U·L-1)4組；空白對照組采用24.4mmol·L-1甘露醇平衡滲透壓差別；按分組分別在5.6、30mmol·L-1葡萄糖濃度下培養(yǎng)3d，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12h。再按分組給予104U·L-1胰島素干預(yù)24h。

1.3 細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的檢測

以2′，7′- 二氯熒光素二乙酸酯(DCFH- DA)法檢測RPE細胞中ROS的水平，應(yīng)用ROS檢測試劑盒按照說明書流程操作。流式細胞儀計數(shù)50000個細胞(波長488nm)檢測平均熒光強度，以反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用配對t檢驗分析高濃度胰島素、高濃度糖及兩者共同作用對RPE細胞ROS的影響，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

如圖1、2所示，空白對照組、高胰島素組、高糖組、高胰島素+高糖組各組均顯示有RPE細胞內(nèi)ROS的表達，高胰島素組、高糖組、高胰島素+高糖組ROS的產(chǎn)生量均明顯多于空白對照組，分別是空白對照組的1.47、1.35、1.86倍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.0、4.203、19.562、P<0.05)，高胰島素+高糖組RPE細胞ROS產(chǎn)量分別是高胰島素組、高糖組的1.27和1.38倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.090、4.028；P<0.05)；高胰島素組與高糖組相比，t=1.285，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1各濃度組ROS的相對表達量

A

B

C

D

A.空白對照組;B.高胰島素組;C.高糖組;D.高胰島素+高糖組

圖2各組ROS表達量

3 結(jié) 論

隨著我國糖尿病患者的增多，DR患者致盲也呈上升趨勢，其發(fā)病率隨著病程的延長而增加。研究發(fā)現(xiàn)，大約一半以上的糖尿病患者在患病5～10年后會發(fā)生眼底病變，15年后則高達75%～80%，其中嚴(yán)重危害性的增生性DR占25%[2]。關(guān)于DR發(fā)生的機制一直是臨床和科研工作者研究關(guān)注的熱點，Brownlee[3]提出的糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的統(tǒng)一機制學(xué)說認(rèn)為，經(jīng)典的多元醇途徑、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑和氨基己糖途徑均是在高糖環(huán)境下，線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導(dǎo)致的結(jié)果。有研究[4]認(rèn)為，2型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生還與炎癥及胰島素抵抗有密切聯(lián)系。

胰島素是由胰島β細胞分泌，是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，胰島素注射被認(rèn)為是控制血糖并減少糖尿病并發(fā)癥的較好手段，但有臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰島素強化治療會引起DR的惡化[5]。

我們的前期試驗證實，高濃度糖條件下培養(yǎng)ARPE- 19可致細胞損傷，抑制增殖，并使ROS生成增加[6]。本次實驗也再次證實了這點，高糖組產(chǎn)生的ROS量顯著高于空白對照組，高胰島素組產(chǎn)生的ROS量也顯著高于空白對照組，說明高胰島素也能引起RPE細胞中ROS的產(chǎn)生增加。而當(dāng)高濃度胰島素作用于高濃度糖條件下培養(yǎng)的RPE細胞時，ROS的產(chǎn)生量明顯高于高濃度糖和高濃度胰島素分別單獨作用于RPE細胞時ROS的產(chǎn)生量，提示高濃度胰島素與高濃度糖對RPE細胞的氧化損傷可以產(chǎn)生協(xié)同作用，這可能就是糖尿病患者行胰島素強化治療時引起DR惡化的機制之一。

[1] MORLEY J E.Diabetes and aging:epidemiologic over view[J].Clin geriatr Med,2008,24(3):395- 405．

[2] BHADURI G,BANDYOPADHYAY M.Challenges to confront diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity[J].J Indian Med Assoc,2005,103:363- 367．

[3] BROWNLEE M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature,2001,414:813- 820．

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[5] The Diabetes Control and Complications Trial.The effect of intensive diabeies treatment on the progession of diabetic retinopathy in insulin- dependent diabetes mellitus[J].Arch Ophthalmol,1995,113(1):36- 51．

[6] 馮麗麗,欒潔,傅敏,等.高糖體外對視網(wǎng)膜色素上皮增生以及活性氧表達的影響[J].國際眼科雜志,2010(3):453- 455．