ApoAI對(duì)原代培養(yǎng)人Müller細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

張紅花，劉瑤

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院 眼科，江蘇 常州 213000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的最主要并發(fā)癥之一，是嚴(yán)重致盲性眼病；視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是DR的主要參與細(xì)胞。而ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白，其在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化修飾、前列環(huán)素的穩(wěn)定、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用[1]。最近研究表明，ApoAI是主要的抗粥樣硬化因子[2]。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道中國(guó)糖尿病人群ApoAI顯著低于健康人群[3]，而apoB與ApoAI的比值顯著高于健康人群[4]，作者擬研究ApoAI對(duì)Müller細(xì)胞增殖與凋亡的影響，以期探討視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞參與DR的始動(dòng)因素。

1 材料與方法

1.1 人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的原代培養(yǎng)

按朱茂麗等[5]報(bào)道的方法稍加改進(jìn)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：取角膜移植后的眼杯(取自于蘇州大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院眼科)，自鋸齒緣后1～2mm處環(huán)形剖開眼球，去除眼前部組織及玻璃體，留后半眼球壁于DMEM培養(yǎng)液中，輕輕剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜組織，將視網(wǎng)膜組織放于含DMEM培養(yǎng)基的一次性塑料培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下將視網(wǎng)膜組織剪成約1mm×1mm大小的組織塊制成組織塊懸液，離心棄上清，加入5倍組織塊體積的0.25%的胰酶懸浮組織塊，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置5min后取出加入等體積的20%FBS的DMEM培養(yǎng)液后用移液器輕輕吹打10次，離心棄上清，加入20%FBS的DMEM培養(yǎng)液再次制成組織塊懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(37℃，體積分?jǐn)?shù)為5CO2)中培養(yǎng)，開始1周不換液，若培養(yǎng)液變黃則小心用移液器吸出部分培養(yǎng)液后加入新鮮培養(yǎng)液，待1周后細(xì)胞爬出后換液，見(jiàn)80%以上的細(xì)胞融合以后傳代培養(yǎng)。經(jīng)免疫組化鑒定培養(yǎng)出的細(xì)胞為視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)方法

以P3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，當(dāng)Müller細(xì)胞達(dá)80%以上融合狀態(tài)時(shí)予以0.25%胰蛋白酶消化，用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液接種至6孔培養(yǎng)板中，置于飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%%CO2培養(yǎng)箱中孵育。24h后取出6孔培養(yǎng)板，小心吸棄原培養(yǎng)液，用無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)液漂洗兩次，不同ApoAI濃度組中分別加入濃度為0、0.01、0.1、1μg·ml-1的DMEM培養(yǎng)液3ml，置于飽和濕度、37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h。

倒置顯微鏡下觀察各組Müller細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Müller細(xì)胞的細(xì)胞周期，0.25%胰酶消化6孔板中的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并收集到流式管中， PBS洗兩次以除去其中的培養(yǎng)液和胰酶等物質(zhì)，然后使用美國(guó)BD公司的DNA異倍體染色試劑盒，按照說(shuō)明書依次加入A、B、C 3種試劑后上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Müller細(xì)胞的凋亡，0.25%胰酶消化六孔板中的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并收集到流式管中， PBS洗兩次以除去其中的培養(yǎng)液和胰酶等物質(zhì)，將細(xì)胞懸液離心棄上清后加入 195μl Annexin V- FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V- FITC輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10min。1000g離心5min，棄上清，加入190μl Annexin V- FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10μl碘化丙啶染色液輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，按上述步驟處理細(xì)胞最后一步不進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，而是離心收集細(xì)胞后用50～100μl Annexin V- FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同藥物濃度組Müller細(xì)胞形態(tài)

各組Müller細(xì)胞呈典型的多角形，大小均勻、邊界清晰、形態(tài)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

A、B、C、D.分別是0、0.01、0.1、1μg·ml-1濃度組的細(xì)胞形態(tài)

圖1不同藥物濃度組培養(yǎng)1d后的細(xì)胞形態(tài)

2.2 不同藥物濃度組人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，藥物處理后G1期細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化(F=0.432,P>0.05)，S期細(xì)胞百分比明顯增多(F=11.007，P<0.05)，G2期細(xì)胞百分比明顯降低(F=20.350，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的細(xì)胞周期分布 %

2.3 Annexin V- FITC/PI細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果

0、0.01、0.1、1μg·ml-14個(gè)不同濃度組別人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的凋亡數(shù)目百分比分別為(10.19±3.49)%、(12.90±2.35)%、(9.86±0.50)%、 (13.91±4.83)%，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，藥物處理后細(xì)胞凋亡百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.166，P=0.381)

2.4 熒光顯微鏡下晚期凋亡和早期凋亡細(xì)胞的形態(tài)

熒光顯微鏡下4組凋亡細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài)未見(jiàn)明顯差異,見(jiàn)圖2。

3 討 論

DR是糖尿病最常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為，Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜血管病變之前其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能就發(fā)生了變化，Müller細(xì)胞的這些變化在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞從視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜延長(zhǎng)至外界膜，貫穿于視網(wǎng)膜感覺(jué)神經(jīng)全層，發(fā)揮著穩(wěn)定視網(wǎng)膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、提供定向支架、從結(jié)構(gòu)和功能上支持視網(wǎng)膜神經(jīng)元和血管、阻止異常光感受器細(xì)胞遷移入視網(wǎng)膜下間隙的功能[7]。因此，探討微環(huán)境內(nèi)外因素對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響有利于我們認(rèn)識(shí)該細(xì)胞在DR過(guò)程中的作用。

A.晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核顯示紅色熒光;B.早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜顯示綠色熒光

圖2熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞的形態(tài)

ApoAI主要是由小腸和肝臟合成的一種載脂蛋白，其主要分布在血漿乳糜顆粒(CM)、HDL2、HDL3中。成熟的人ApoAI由243個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為28 300。ApoAI在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制LDL的氧化修飾、前列環(huán)素的穩(wěn)定、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用[8]。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道中國(guó)糖尿病人群ApoAI顯著低于健康人群，而apoB與ApoAI的比值顯著高于健康人群[9]。

本實(shí)驗(yàn)中，加入ApoAI后處于S期的細(xì)胞比例明顯增加，而相應(yīng)的G2期細(xì)胞明顯減少，并且隨著ApoAI濃度的增加這種趨勢(shì)更加明顯。說(shuō)明ApoAI可以抑制Müller細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞增殖過(guò)程阻滯在S期和G2期之間。因此，ApoAI可能是通過(guò)阻滯細(xì)胞的分裂來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。

在本次細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，加入ApoAI的流式結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡比例沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明ApoAI對(duì)Müller細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯作用，也表明ApoAI對(duì)Müller細(xì)胞的作用應(yīng)該是通過(guò)其它路徑，即可能通過(guò)阻滯細(xì)胞的分裂來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。

綜上所述，ApoAI可以抑制人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用隨著ApoAI濃度的增加而增強(qiáng)；ApoAI對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯作用。由此我們可以推斷，糖尿病狀態(tài)下由于ApoAI的顯著降低以及apoB與ApoAI的比值顯著增高，可能解除了對(duì)于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞抑制作用，從而促進(jìn)了DR的發(fā)生。

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