ApoAI對原代培養人Müller細胞生長的影響

張紅花，劉瑤

(蘇州大學附屬第三醫院 眼科，江蘇 常州 213000)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的最主要并發癥之一，是嚴重致盲性眼病；視網膜Müller細胞是DR的主要參與細胞。而ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的主要載脂蛋白，其在膽固醇逆向轉運、抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化修飾、前列環素的穩定、保護血管內皮細胞以及穩定細胞膜結構中發揮重要作用[1]。最近研究表明，ApoAI是主要的抗粥樣硬化因子[2]。國內已有報道中國糖尿病人群ApoAI顯著低于健康人群[3]，而apoB與ApoAI的比值顯著高于健康人群[4]，作者擬研究ApoAI對Müller細胞增殖與凋亡的影響，以期探討視網膜Müller細胞參與DR的始動因素。

1 材料與方法

1.1 人視網膜Müller細胞的原代培養

按朱茂麗等[5]報道的方法稍加改進進行細胞培養：取角膜移植后的眼杯(取自于蘇州大學第三臨床醫學院眼科)，自鋸齒緣后1～2mm處環形剖開眼球，去除眼前部組織及玻璃體，留后半眼球壁于DMEM培養液中，輕輕剝取視網膜組織，將視網膜組織放于含DMEM培養基的一次性塑料培養皿中，在解剖顯微鏡下將視網膜組織剪成約1mm×1mm大小的組織塊制成組織塊懸液，離心棄上清，加入5倍組織塊體積的0.25%的胰酶懸浮組織塊，細胞培養箱放置5min后取出加入等體積的20%FBS的DMEM培養液后用移液器輕輕吹打10次，離心棄上清，加入20%FBS的DMEM培養液再次制成組織塊懸液接種于培養瓶中，置于恒溫恒濕培養箱(37℃，體積分數為5CO2)中培養，開始1周不換液，若培養液變黃則小心用移液器吸出部分培養液后加入新鮮培養液，待1周后細胞爬出后換液，見80%以上的細胞融合以后傳代培養。經免疫組化鑒定培養出的細胞為視網膜Müller細胞。

1.2 實驗分組與實驗方法

以P3代對數生長期的人視網膜Müller細胞用于實驗，當Müller細胞達80%以上融合狀態時予以0.25%胰蛋白酶消化，用含20%FBS的DMEM培養液制成細胞懸液接種至6孔培養板中，置于飽和濕度、37℃、體積分數為5%%CO2培養箱中孵育。24h后取出6孔培養板，小心吸棄原培養液，用無FBS的DMEM培養液漂洗兩次，不同ApoAI濃度組中分別加入濃度為0、0.01、0.1、1μg·ml-1的DMEM培養液3ml，置于飽和濕度、37℃、體積分數為5%%CO2培養箱中繼續孵育24h。

倒置顯微鏡下觀察各組Müller細胞形態。流式細胞術檢測Müller細胞的細胞周期，0.25%胰酶消化6孔板中的細胞制成單細胞懸液并收集到流式管中， PBS洗兩次以除去其中的培養液和胰酶等物質，然后使用美國BD公司的DNA異倍體染色試劑盒，按照說明書依次加入A、B、C 3種試劑后上機檢測。流式細胞術檢測Müller細胞的凋亡，0.25%胰酶消化六孔板中的細胞制成單細胞懸液并收集到流式管中， PBS洗兩次以除去其中的培養液和胰酶等物質，將細胞懸液離心棄上清后加入 195μl Annexin V- FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5μl Annexin V- FITC輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10min。1000g離心5min，棄上清，加入190μl Annexin V- FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10μl碘化丙啶染色液輕輕混勻，冰浴避光放置，隨即進行流式細胞儀檢測。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態，按上述步驟處理細胞最后一步不進行流式細胞儀檢測，而是離心收集細胞后用50～100μl Annexin V- FITC結合液輕輕重懸細胞，涂片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理

實驗數據均以均數±標準差表示，應用SPSS統計軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同藥物濃度組Müller細胞形態

各組Müller細胞呈典型的多角形，大小均勻、邊界清晰、形態無明顯差異。見圖1。

A、B、C、D.分別是0、0.01、0.1、1μg·ml-1濃度組的細胞形態

圖1不同藥物濃度組培養1d后的細胞形態

2.2 不同藥物濃度組人視網膜Müller細胞的細胞周期分布

采用單因素方差分析的統計方法，藥物處理后G1期細胞百分比無明顯變化(F=0.432,P>0.05)，S期細胞百分比明顯增多(F=11.007，P<0.05)，G2期細胞百分比明顯降低(F=20.350，P<0.05)。見表1。

表1 各組人視網膜Müller細胞的細胞周期分布 %

2.3 Annexin V- FITC/PI細胞凋亡的檢測結果

0、0.01、0.1、1μg·ml-14個不同濃度組別人視網膜Müller細胞的凋亡數目百分比分別為(10.19±3.49)%、(12.90±2.35)%、(9.86±0.50)%、 (13.91±4.83)%，采用單因素方差分析的統計方法，藥物處理后細胞凋亡百分比差異無統計學意義(F=1.166，P=0.381)

2.4 熒光顯微鏡下晚期凋亡和早期凋亡細胞的形態

熒光顯微鏡下4組凋亡細胞的數目及形態未見明顯差異,見圖2。

3 討 論

DR是糖尿病最常見而嚴重的并發癥之一，近幾年國內外學者研究認為，Müller細胞在視網膜血管病變之前其形態結構和生理功能就發生了變化，Müller細胞的這些變化在DR的發生發展中起重要作用[6]。Müller細胞是視網膜的主要神經膠質細胞，該細胞從視網膜的內界膜延長至外界膜，貫穿于視網膜感覺神經全層，發揮著穩定視網膜的復雜結構、提供定向支架、從結構和功能上支持視網膜神經元和血管、阻止異常光感受器細胞遷移入視網膜下間隙的功能[7]。因此，探討微環境內外因素對視網膜Müller細胞的影響有利于我們認識該細胞在DR過程中的作用。

A.晚期凋亡細胞的細胞核顯示紅色熒光;B.早期凋亡細胞的細胞膜顯示綠色熒光

圖2熒光顯微鏡下凋亡細胞的形態

ApoAI主要是由小腸和肝臟合成的一種載脂蛋白，其主要分布在血漿乳糜顆粒(CM)、HDL2、HDL3中。成熟的人ApoAI由243個氨基酸組成，相對分子質量為28 300。ApoAI在膽固醇逆向轉運、抑制LDL的氧化修飾、前列環素的穩定、保護血管內皮細胞以及穩定細胞膜結構中發揮重要作用[8]。國內已有報道中國糖尿病人群ApoAI顯著低于健康人群，而apoB與ApoAI的比值顯著高于健康人群[9]。

本實驗中，加入ApoAI后處于S期的細胞比例明顯增加，而相應的G2期細胞明顯減少，并且隨著ApoAI濃度的增加這種趨勢更加明顯。說明ApoAI可以抑制Müller細胞的增殖，使細胞增殖過程阻滯在S期和G2期之間。因此，ApoAI可能是通過阻滯細胞的分裂來抑制細胞的增殖。

在本次細胞凋亡實驗中，加入ApoAI的流式結果顯示細胞凋亡比例沒有明顯變化，說明ApoAI對Müller細胞的凋亡無明顯作用，也表明ApoAI對Müller細胞的作用應該是通過其它路徑，即可能通過阻滯細胞的分裂來抑制細胞的增殖。

綜上所述，ApoAI可以抑制人視網膜Müller細胞的增殖，且這種抑制作用隨著ApoAI濃度的增加而增強；ApoAI對細胞凋亡無明顯作用。由此我們可以推斷，糖尿病狀態下由于ApoAI的顯著降低以及apoB與ApoAI的比值顯著增高，可能解除了對于視網膜Müller細胞抑制作用，從而促進了DR的發生。

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