急性早幼粒白血病細胞ATRA耐藥株HL- 60R、NB4R的構建及鑒定

張亞芬，張瑩，繆鳳琴，張建瓊

(東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，發育與疾病相關基因教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓系白血病中的M3亞型，占所有急性髓系白血病的10%～15%[1]。全反式維甲酸(all- trans retinoic acid，ATRA)聯合以蒽環類藥物為主的化療方案是臨床上APL誘導緩解的首選療法[2- 4]，而ATRA治療時耐藥性的產生是導致其治療失敗的主要原因。本實驗以ATRA為誘導藥物，采用濃度遞增間歇誘導法建立了APL細胞的ATRA耐藥株HL- 60R、NB4R，并對耐藥細胞的生物學性狀進行了初步探討。該細胞系的建立為深入探討人急性早幼粒細胞白血病細胞ATRA耐藥機制提供了工具細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ATRA(Sigma公司)、依托泊苷(etoposide，VP- 16，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、硫酸長春新堿(vincristine sulfate，VCR，浙江海正藥業股份有限公司)、阿糖胞苷(cytarabine，Ara- C，輝瑞制藥有限公司)、多柔比星(doxorubicin，ADM，輝瑞制藥有限公司)、RPMI- 1640培養基(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)、鏈霉素(Thermo Scientific公司)、CCK8(Dojindo公司)。

1.1.2 細胞 人APL細胞系HL- 60購自中國科學院細胞庫，人APL細胞系NB4由南京市鼓樓醫院惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HL- 60、NB4細胞以RPMI- 1640培養基(含10%胎牛血清、青霉素120μg·ml-1、鏈霉素100μg·ml-1)于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。

1.2.2 ATRA耐藥細胞株的誘導 根據文獻報道采用濃度遞增間歇誘導法進行耐藥細胞株的構建[5- 6]：取對數生長期細胞，在含10-9mol·L-1ATRA培養基中培養48h；以普通培養基培養2～3代后提高ATRA濃度1倍，如此反復，最終誘導出在含10-6mol·L-1ATRA培養基中仍能保持增殖和分化狀態的細胞系，分別命名為HL- 60R、NB4R，且細胞始終培養于含10-6mol·L-1ATRA培養基中用于實驗。

1.2.3 HL- 60R、NB4R細胞對ATRA耐藥性的鑒定 以HL- 60R細胞為例，設置4組：HL- 60、HL60+ATRA、HL- 60R、HL- 60R+ATRA組，以每孔5000個細胞接種于96孔板，培養48h后每孔加入10μl CCK8溶液，繼續培養4h，酶標儀讀取吸光度值，并計算各組細胞的存活率。

1.2.4 生長曲線測定 以HL- 60、HL- 60R細胞為例，取對數生長期的HL60、HL60R細胞，以每孔1000個細胞接種至6孔板，分別在普通培養基或含10-6mol·L-1ATRA培養基中培養，于第1、2、3、4、5、6天進行細胞計數，繪制生長曲線，并根據Patterson公式計算細胞的群體倍增時間。

1.2.5 耐藥譜分析 以HL- 60R細胞為例，取對數生長期HL- 60及HL- 60R細胞，以每孔5000個細胞接種于96孔板，每孔加入不同濃度的各化療藥物(VCR、ADM、VP- 16、Ara- C)，藥物終濃度參照臨床使用時的血漿峰濃度(peak plasma concentration，PPC)[7]，培養48h后每孔加入10μl CCK8溶液，繼續培養4h，酶標儀讀取吸光度值并計算各化療藥物對細胞的抑制率。

參照藥敏試驗評價標準[8]，若藥物對細胞的抑制率﹥50%，代表細胞對藥物敏感；若藥物對細胞的抑制率為30%～50%，代表細胞對藥物部分耐受；若藥物對細胞的抑制率﹤30%，代表細胞對藥物耐受。

1.3 統計學處理

采用SPSS18.0統計軟件進行分析，樣本均數比較用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05則差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 構建HL- 60R、NB4R耐藥細胞株

本實驗采用濃度遞增間歇誘導法，歷時4.5個月，成功建立了HL- 60、NB4細胞相應的ATRA耐藥株，并以CCK8法對其ATRA耐藥性進行了鑒定(圖1)；且耐藥株經凍存復蘇后的生長狀態良好，耐藥性保持穩定。

2.2 HL- 60R、NB4R細胞的生物學性狀

2.2.1 細胞形態學觀察 光鏡下(未染色)觀察發現(圖2)，親代及耐藥細胞均懸浮生長，耐藥細胞體積有所增大，且大小不一；此外HL- 60細胞呈單個生長，而相應的耐藥株HL- 60R則出現少量成團生長現象。

圖1HL- 60R和NB4R細胞的ATRA耐藥性鑒定

Fig1IdentificationofHL- 60RandNB4Rcells’ATRAresistance

圖2光鏡下的的HL- 60和HL- 60R細胞

Fig2HL- 60andHL- 60Rcellsunderlightmicroscope

2.2.2 HL- 60R、NB4R細胞的生長曲線 親代及耐藥細胞在相同培養基下增殖情況有一定差異：在普通培養基下耐藥細胞的生長速度減慢，生長曲線的斜率減小(圖3)，群體倍增時間延長(HL- 60為21.86h，HL- 60R為27.5h，NB4為20.75h，NB4R為25.94h)；在含ATRA培養基中親代細胞培養72h后幾乎全部死亡，而耐藥細胞則生長良好。

圖3HL-60R和NB4R細胞的生長曲線

Fig3ThegrowthcurvesofHL-60andHL-60R

2.3 HL- 60R、NB4R細胞呈現多藥耐藥性

從圖4的耐藥譜來看，參照藥敏試驗的評價標準，HL- 60R細胞對VP- 16、ADM這兩種化療藥物具有耐藥性，對VCR、Ara- C具有部分耐藥性；而NB4R細胞對這4種化療藥物均具有部分耐藥性。

3 討 論

目前臨床上APL治療的首選方法是ATRA聯合蒽環類藥物為主的化療，該方法能夠使患者的初治完全緩解率達80～95%[2，9- 10]，是腫瘤誘導分化療法最成功的模式。然而，用ATRA進行治療時20%～30%的APL患者會產生耐藥反應，在完全緩解后3～6個月內復發，且再次緩解后的3年總體生存率僅為50%左右，嚴重影響了ATRA的療效，甚至導致治療失敗[11- 12]。因此，ATRA耐藥性的產生是目前臨床上APL化療失敗的主要原因，所以研究ATRA的耐藥機制并尋求逆轉耐藥的有效措施是目前APL研究的一大方向。而構建理想的耐藥細胞系是研究耐藥細胞生物學變化、耐藥發生機制以及探索逆轉耐藥的新型藥物的重要基礎。

圖4HL-60R和NB4R細胞的耐藥譜

Fig4Cross-drugresistanceprofilesofHL-60RandNB4R

本研究采用濃度遞增間歇誘導法，歷時4.5個月，成功建立了具有多藥耐藥特征的ATRA耐藥細胞株HL- 60R、NB4R。這兩株耐藥細胞在含10-6mol·L-1ATRA培養基中生長良好，且經凍存復蘇后耐藥性仍保持穩定。耐藥細胞株的誘導過程實際上是篩選細胞的過程，由于細胞的異質性，大部分對藥物敏感的細胞被殺死，僅有少數不敏感的細胞存活下來并得以擴增。

比較親代細胞及耐藥細胞的生物學特性發現，與親代細胞相比耐藥細胞體積有所增大，且大小不一；對VP- 16、ADM、VCR、Ara- C等其它化療藥物也產生了一定程度的耐藥性，即耐藥細胞株HL- 60R、NB4R具有多藥耐藥特征。

此外，通過繪制細胞生長曲線并計算細胞的群體倍增時間發現，相較于親代細胞耐藥細胞株HL- 60R、NB4R的生長增殖速度減慢、群體倍增時間明顯延長。研究表明腫瘤細胞的群體倍增時間越短，其對化療藥物越敏感，療效越好；反之，細胞群體倍增時間延長，表明其對化療藥物的敏感性降低[13]。這與我們的結果相一致。

綜上所述，本研究構建了APL細胞的ATRA耐藥株HL- 60R、NB4R，其耐藥性穩定且具備一定的多藥耐藥性狀。這兩株ATRA耐藥細胞的成功構建為進一步從細胞和分子水平研究APL細胞的多藥耐藥機制提供了有效的細胞模型，為尋找APL細胞多藥耐藥的逆轉策略及篩選或開發新的APL治療藥物等提供了必要的實驗材料，同時對于預防和延緩APL臨床耐藥性的發生、提高APL的治療效果具有重要意義。

[1] SHAFFER B C，GILLET J P，PATEL C，et al.Drug resistance:still a daunting challenge to the successful treatment of AML[J].Drug Resistance Updates，2012，15(1- 2):62- 69.

[2] LALLEMAND- BREITENBACH V，ZHU J，CHEN Z，et al.Curing APL through PML/RARA degradation by As2O3[J].Trends in Molecular Medicine，2012，18(1):36- 42.

[3] FANG J，CHEN S J，TONG J H，et al.Treatment of acute promyelocytic leukemia with ATRA and As2O3:a model of molecular target- based cancer therapy[J].Cancer Biology & Therapy，2002，1(6):614- 620.

[4] 賀白，顧偉英，曹祥山，等.急性早幼粒細胞白血病患者早期死亡的臨床分析[J].現代醫學，2011，39(2):169- 172.

[5] 蔡倩，徐酉華，劉筱梅，等.HSP90β在ATRA誘導的白血病細胞株HL60耐藥中的作用研究[J].重慶醫科大學學報，2010，35(11):1658- 1661.

[6] 薛芳，成志勇，楊琳，等.白血病耐藥細胞系U937/ADR的建立及其生物學性狀[J].中國生物工程雜志，2009，29(7):17- 21.

[7] 陳新峰,楊菁.用MTT法進行白血病體外藥物敏感性檢測的臨床意義[J].福建醫科大學學報，2009，43(2):169- 171，177.

[8] 蘇祖祿，蘇海，張毅，等.腦膠質瘤化療藥物的體外敏感性試驗研究[J].第三軍醫大學學報，2013，35(13):1420- 1423.

[9] SANZ M A,LO- COCO F.Modern approaches to treating acute promyelocytic leukemia[J].Journal of Clinical Oncology，2011，29(5):495- 503.

[10] CORNELL R F,PALMER J.Adult acute leukemia[J].Disease- a- month :DM，2012，58(4):219- 238.

[11] ARTEAGA M F，MIKESCH J H，QIU J，et al.The histone demethylase PHF8 governs retinoic acid response in acute promyelocytic leukemia[J].Cancer Cell，2013，23(3):376- 389.

[12] 陳賽娟.白血病發病原理和靶向治療研究——從急性早幼粒細胞到其他類型白血病[J].中華血液學雜志，2010，31:3- 6.

[13] 張南文,許建華.人結腸癌耐藥細胞系SW480/L- OHP的建立及其耐藥機制初探[J].福建醫科大學學報，2013(4):228- 231.