別嘌醇對2型糖尿病小鼠腎小管間質細胞表型改變的保護作用與機制

張 濤 李 亞 遲雁青 劉茂東 李 英

(河北醫科大學第三醫院腎內科，河北 石家莊 050051)

糖尿病腎病(DN)作為糖尿病最常見的并發癥之一，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因，目前尚缺乏有效治療手段阻抑DN的進展。流行病學調查顯示，2型糖尿病在總體糖尿病發病人群中仍占大多數，且多合并胰島素抵抗、高尿酸血癥、高脂血癥等代謝異常。晚近越來越多的研究數據顯示，糖尿病患者中合并高尿酸血癥的比例明顯高于普通人群。有專家指出尿酸已成為慢性腎臟病進展的獨立危險因素〔1〕。以往DN基礎研究多集中在高糖、高脂因素對腎小球硬化的影響，而關于高尿酸血癥對DN發病及進展影響及其干預研究卻很罕見。本研究擬以2型糖尿病小鼠作為研究對象，通過別嘌醇的干預研究，探討尿酸管理對DN腎小管間質病變進程的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 兔抗增殖因子(prohibitin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子β(TGF-β)、E-鈣黏素(E-cadherin)多克隆抗體購自美國proterntech公司；免疫組化試劑盒購自北京中衫金橋生物有限公司；別嘌醇購自廣東彼迪藥業有限公司。

1.2實驗分組 4～6周齡雄性SPF級肥胖性2型糖尿病動物模型C57BL/Ksj db/db小鼠12只和對照C57BL/Ksj db/m小鼠6只購自南京大學模式動物研究所。適應性喂養2 w后將db/db小鼠隨機分為兩組：db/db 小鼠對照組(db/db組)、db/db小鼠+別嘌醇50 mg·kg-1·d-1治療組 (db/db + A組)。db/m小鼠作為正常對照組(db/m組)。

1.3標本收集 各組小鼠喂養至12 w，處死前1 d放入代謝籠，禁食不禁水，收集小鼠24 h尿液。股靜脈取血留血清用于生化指標檢測；處死后取部分腎皮質置于4%多聚甲醛固定24 h，用于病理學及免疫組化檢查；其余腎組織置于干燥EP管中，放入液氮中保存，用于Western印跡檢測。

1.4血尿生化指標檢測 血糖(Glu)、血尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血甘油三酯(TG)、24 h尿蛋白定量(Pro)用AU2700型自動生化分析儀檢測。

1.5腎組織病理學檢查 將2 μl石蠟切片分別行糖原(PAS)和膠原纖維(Masson)染色，光鏡下觀察腎小管間質病理學改變。

1.6免疫組化檢測腎皮質prohibitin、TGF-β、α-SMA、E-cadherin的表達 4 μl石蠟切片常規脫蠟至水，微波熱修復抗原；0.3%過氧化氫室溫孵育20 min；正常山羊血清37℃封閉30 min；分別滴加兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗TGF-β、α-SMA、E-cadherin多克隆抗體(均按1∶200稀釋)4℃過夜；滴加羊抗兔二抗，37℃放置20 min；滴加鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)37℃放置20 min；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染1～3 min；常規脫水透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察拍片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。應用HPIAS 2000型圖像分析系統半定量分析，每張切片在高倍鏡(×200)下隨機選取10個不重疊視野，測量光密度值。

1.7Western印跡檢測腎皮質prohibitin、TGF-β蛋白的表達 取100 mg腎皮質，加入預冷RIPA蛋白裂解液置冰上充分勻漿，4℃12 000 r/min離心20 min，收集上清，二喹啉甲酸二鈉鹽(BCA)法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加封閉液稀釋的兔抗prohibitin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗TGF-β多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，β-actin(1∶2 000稀釋)4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)37℃反應1 h，再次洗膜后加電化學發光法(ECL)反應液發光。Gel-pro分析軟件對條帶進行統計分析，以β-actin作為內參進行校正，各條帶與β-actin蛋白條帶的光密度值之比進行半定量分析。

2 結 果

2.1各組生化指標比較 db/db組、db/db+A組間Glu無明顯差異(P>0.05)，均顯著高于db/m組(P<0.05)。db/db組血漿UA、TG、BUN水平、24 h尿蛋白定量在12 w末均明顯高于db/m組(P<0.05)，db/db+A組上述指標較同時期db/db組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠12 w末血尿生化指標比較

2.2腎小管間質病理學改變 與db/m組相比，db/db組腎小管間質增寬，腎小管基底膜增厚，胞外基質增多，可見灶性淋巴細胞及單核細胞浸潤；腎小管上皮細胞可見刷狀緣脫落，部分細胞腫脹、空泡變性，甚至脫落；腎小管管腔擴張，部分可見蛋白管型。db/db+A組上述小管間質病變較db/db組有所改善。見圖1。

2.3各組小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA蛋白的表達 在正常對照組腎組織中，α-SMA蛋白僅表達于血管平滑肌，在腎間質偶有表達；但在db/db組α-SMA蛋白廣泛分布于腎小管間質區域的小管上皮和間質細胞的胞質中，呈棕黃色顆粒樣表達；db/db+A組α-SMA蛋白表達強度較db/db組有所減弱。正常對照組大鼠腎組織E-cadherin表達于腎小管上皮細胞胞膜，尤以細胞連接處為主，呈較強表達，db/db組E-cadherin的表達較db/m組顯著減少，而db/db+A組E-cadherin表達仍低于db/m組，但卻明顯高于db/db組。見圖2。

2.4各組小鼠腎組織prohibitin、TGFβ蛋白的表達 免疫組化結果顯示，在db/m組可見prohibitin蛋白的陽性表達，主要定位于腎小管上皮細胞和腎間質細胞的胞質，胞核內亦有較弱表達，在腎小球固有細胞無明顯陽性表達。db/db組prohibitin蛋白表達強度較db/m組減弱，db/db+A組prohibitin蛋白表達仍低于db/m組，但較db/db組有所增強。正常對照組TGF-β蛋白在腎小球系膜區，腎小管上皮細胞胞質、腎小管基底膜及管周毛細血管可見較弱表達，而db/db組TGF表達明顯增強，尤以腎小管上皮細胞胞質變化明顯，db/db+A組較db/db組有所降低。見圖2。

Western印跡結果顯示，與db/m組相比，db/db組小鼠腎皮質內prohibitin蛋白表達減弱(P<0.01)，db/db+A組較db/db組有所增強(P<0.01)；TGF-β蛋白在db/m組表達很低，而db/db組較正常對照組明顯增強(P<0.01)，db/db+A組較db/db組有所下降(P<0.01)。見圖3。

圖1 各組小鼠12 w末腎組織病理變化(×400)

圖2 各組小鼠12周末腎組織prohibitin、TGF-β、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(免疫組化，×400)

與db/m組比較：1)P<0.01;與db/db組比較：2)P<0.01

3 討 論

DN是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥之一，目前已成為終末期腎衰竭的最重要病因之一。既往研究認為DN的早期病變發生在腎小球，但近年來的研究發現，腎小管間質病變無論從發病時間或發病機制均具有獨立性，且腎小管間質纖維化程度與腎功能的相關性比腎小球硬化更為密切。腎間質纖維化是導致腎功能惡化快速進展的主要原因，其機制學說眾多。有研究指出，腎臟固有細胞包括上皮細胞、成纖維細胞、系膜細胞等，在各種損傷因素的刺激下，可向肌成纖維細胞表型轉變，最終變為分泌基質蛋白的效應細胞，它不僅能合成、分泌細胞外基質，還能分泌細胞因子、炎癥介質等以旁分泌的方式影響鄰近細胞，放大其致纖維化效應〔2〕。因此，有學者指出腎小管上皮-肌成纖維細胞轉分化(TEMT)在腎小管間質纖維化進展中起著重要作用。

E-cadherin是上皮細胞的標志蛋白，是構成腎小管上皮細胞間緊密連接的重要成分，在保持細胞正常結構和極性中起重要作用。當致病因素作用于腎小管上皮細胞，導致E-cadherin丟失，細胞間緊密連接破壞，上皮細胞黏附特性喪失，胞質內細胞骨架重排，表達間充質細胞表型標志蛋白如α-SMA，是TEMT的發生過程。有研究認為α-SMA作為腎小管上皮細胞轉分化的標志，其表達量與腎小管間質纖維化程度及腎功能惡化程度呈正相關〔3〕。本研究發現實驗12 w末時糖尿病小鼠腎小管上皮細胞的標志性蛋白E-cadherin的表達下調，而肌原纖維細胞的特征性標志蛋白α-SMA的表達升高，提示糖尿病小鼠腎臟已發生了腎小管上皮細胞間充質轉分化。同時糖尿病小鼠腎臟病理也發生了明顯改變，再次提示腎小管間質轉分化可能是糖尿病腎間質纖維化的基礎。

尿酸是嘌呤代謝的最終產物，由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶(XO)的作用下生成。無論體內尿酸生成增多和(或)排泄減少均可導致高尿酸血癥。近年研究發現，高尿酸血癥在2型糖尿病和糖代謝異常人群中的發病率明顯高于正常人群。已有橫斷面流行病學調查顯示，血尿酸在腎臟疾病進展中發揮重要作用，高尿酸血癥可能是慢性腎臟病(CKD)進展的獨立危險因素〔4〕。另外已有多項研究指出，高尿酸血癥可加速2型糖尿病患者DN的發生和發展〔5〕，因此早期干預高尿酸血癥對于延緩DN的進展、防止終末期腎衰竭具有重要意義。別嘌醇是次黃嘌呤的同分異構體，可抑制XO活性，進而抑制尿酸生成。已獲臨床循證醫學證據，應用別嘌醇干預CKD高尿酸血癥對于延緩慢性腎損害進展是有益和安全的。特別是針對糖尿病蛋白尿患者進行的隨機雙盲對照試驗，應用別嘌醇干預治療數月，對于蛋白尿的控制取得了一定療效〔6〕。另有1型糖尿病模型動物實驗也顯示，別嘌醇對腎臟具有保護作用〔7，8〕。本文結果提示別嘌醇可通過降低血尿酸減緩DN進展。

腎小管上皮細胞是尿酸作用最直接的靶細胞之一，但其作用機制尚不明了。晚近研究認為，尿酸可能通過啟動氧化應激、炎癥反應、誘導細胞轉分化和凋亡等機制導致腎小管間質損傷〔9～11〕，其中涉及的具體分子途徑還有待證實。Quan等〔12〕應用尿酸刺激腎小管上皮細胞檢測出數十種與細胞增殖和凋亡相關的蛋白變化，且這些蛋白的功能與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路關系密切，其中prohibitin可能與腎小管上皮細胞轉分化有關。此前，黃文彥等〔13〕通過腎間質纖維化大鼠模型尋找可能介導間質纖維化的基因表達譜研究中也發現了prohibitin 的表達下調。Chen等〔14〕對高糖誘導視網膜色素上皮細胞蛋白組學變化的研究中也提到了prohibitin，并指出其與糖尿病視網膜病變的關系頗為密切。

prohibitin基因是一種新近發現的腫瘤抑制基因，其表達產物prohibitin蛋白具有高度結構保守型和種族同源性，主要定位于細胞線粒體內膜、細胞核和細胞膜，并在不同部位發揮相應的調控作用，如維持線粒體結構和功能，調節細胞能量代謝；通過對細胞周期和轉錄調控，抗細胞增殖和凋亡等〔15〕。已有研究顯示，prohibitin與腎小管間質損傷有關。在單側輸尿管梗阻(UUO)腎間質纖維化模型和鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病大鼠模型中，腎間質prohibitin表達減低，且與纖維化程度呈負相關〔16，17〕。另外有研究顯示，外源性prohibitin可顯著抑制TGF-β誘導的腎間質成纖維細胞增殖和表型改變〔18〕。TGF-β是目前公認的最重要的促纖維化因子，且被證實是誘導上皮細胞表型轉化最重要的細胞因子。由此可以推測TGF-β和prohibitin可能共同參與了DN腎小管間質纖維化的進程。本研究結果也提示DN時，高尿酸血癥可能通過抑制prohibitin的表達，增加TGFβ表達誘導腎小管間質轉分化，從而加速腎間質纖維化進程。prohibitin作為線粒體內膜蛋白調控線粒體結構和功能完整是人們對該蛋白最早的認識，prohibitin表達缺失可導致多種組織細胞出現線粒體氧化功能異常、活性氧簇(ROS)合成增多，進而引發一系列細胞因子、信號通路表達及活性異常導致細胞損傷。prohibitin與TGF-β的相互作用機制仍需進一步研究證實。

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