15-脂氧化酶在動脈粥樣硬化形成中的作用及卡維地洛的干預效果

董 賓 楊金輝 趙慧穎

(吉林大學第一醫院老年病科，吉林 長春 130021)

炎癥和一些氧化應激反應可能是動脈粥樣硬化(AS)，AS發展的關鍵因素〔1〕。15-脂氧化酶(15-LO)是一種非鐵血紅素氧化酶，可以氧化游離多不飽和脂肪酸，其產物15-羥基二十碳四烯酸能夠通過增加內皮細胞細胞間黏附因子(ICAM)-1的表達來促進單核細胞的黏附；15-LO氧化脂質的活性增高或過表達可加速早期AS的發生，而抑制15-LO及其產物的活性則可顯著延緩AS的發生與發展，因此被認為與AS密切相關?？ňS地洛是一種非選擇性的腎上腺素能受體阻滯劑,兼有β受體和α1受體的雙重阻滯作用,并且有抗氧化和抗細胞增殖作用，能阻抑氧自由基對血管內皮細胞及平滑肌細胞的損傷，廣泛用于心力衰竭、高血壓、冠心病等疾病的治療。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 健康雄性Wistar大鼠，體重220～250 g，購自吉林大學實驗動物中心。主要實驗藥品卡維地洛(達利全，購自上海羅氏制藥有限公司)，腫瘤壞死因子(TNF)-α(購于武漢博士德生物工程有限公司，EK0526)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所第一分所，A001)， 15-LO一抗(購于上海麥莎生物科技有限公司，MS-1460)1∶150。SP試劑盒和液體二氨基聯苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒(購于廣州市寶泰克生物科技有限公司)。

1.2儀器與設備 主要實驗器材：UV-260紫外分光光度計(日本島津公司)，微量式轉移器(德國Gilson公司)，標準規格酶標儀(美國雷博公司)。

1.3動物模型制備與分組 30只健康雄性Wistar大鼠，適應喂養1 w后，隨機分為以下三組：①正常對照組10只，飼以正常飼料。②AS組10只，飼以促AS飼料。促AS飼料在正常飼料基礎上加入2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、維生素D3粉劑(1.25×106μg/kg飼料)、3%豬油。③ 卡維地洛組10只，以促AS飼料及卡維地洛20 mg/kg體重，1次/d灌胃。實驗開始予②、③組大鼠30萬U/kg體重維生素D3右下肢肌肉注射，每3周重復給予上述劑量維生素D3右下肢肌肉注射。實驗過程中正常對照組因腹瀉死亡1只，AS組在注射維生素D3第2天不明原因死亡1只，卡維地洛組因腹部皮膚膿腫死亡1只。

1.4標本處理 9 w后，所有大鼠均禁食24 h，以戊巴比妥鈉30 mg/kg體重腹腔麻醉，剪開腹部正中皮膚及肌肉，分離腹主動脈，在腎動脈分叉下剪開腹主動脈，插入深靜脈插管，用注射器采集動脈血。之后剪下胸腹主動脈及頸總動脈，自主動脈弓下約1 cm處留取動脈組織1 cm立即用4%甲醛溶液固定，用于常規形態學和免疫組織化學檢查，離心后的血清置于-20℃冰箱保存以備用。

1.5檢測指標 血脂的檢測：在吉林大學第一臨床醫院生化科完成。SOD的檢測按照SOD試劑盒說明內的書進行。TNF-α的檢測,動脈組織行蘇木素-伊紅(HE)染色，15-LO 行免疫組織化學染色。免疫組化結果半定量分析：在彩色圖像分析系統上，每個切片隨機取5個高倍視野，15-LO在血管的陽性表達以面密度表示，同上述方法測5個視野，計算公式：面密度=目標總面積/統計場總面積。

2 結 果

2.1體重變化 AS組、卡維地洛組體重在3 w后較實驗前明顯增高(P<0.01)，其后6、9 w時體重與3 w時無明顯變化，組間各時期體重變化無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2血脂改變 9 w后血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與正常對照組比較，其他兩組明顯升高(P<0.01)，而這兩組間無明顯差異(P>0.05)。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與正常對照組相比，其他兩組明顯降低(P<0.01)，而這兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各實驗組體重變化情況

表2 實驗9 w后各組血脂變化情況

2.3血清中SOD和TNF-α的含量 9 w后測得血清中SOD與正常對照組比較，AS組SOD含量〔(185.8±4.1)U/ml〕明顯降低(P<0.01)，卡維地洛組〔(214.5±17.8)U/ml〕與正常對照組〔(223.8±12.7)U/ml〕比較無統計學意義(P>0.05)；血清中TNF-α與正常對照組〔(45.3±1.2)pg/ml〕比較，其他兩組明顯升高〔AS組(62.1±4.9)pg/ml、卡維地洛組(50.7±1.9)pg/ml〕(P<0.01)，而這兩組間也有明顯差異(P<0.01)。

2.4各組主動脈病理形態學檢測 正常對照組胸主動脈壁各層結構清晰，內皮細胞完整，中層平滑肌細胞排列正常無增生，外層為疏松結締組織；AS組可見動脈內膜呈偏心性增厚，斑塊內充滿泡沫細胞，內膜有大量炎細胞及增生的平滑肌細胞，中層平滑肌細胞增生；卡維地洛組血管內膜其間可見少量散在的脂質沉積、炎癥細胞和泡沫細胞，中膜平滑肌細胞均無明顯增生。見圖1。

2.5各組大鼠主動脈內膜15-LO的陽性表達 正常對照組血管內膜均未見明顯的15-LO陽性表達；AS組的內皮細胞胞漿可見15-LO表達明顯增多，呈棕褐色，部分呈點狀、片狀著色；卡維地洛組的內皮細胞胞漿中見少量15-LO表達。見圖2。

正常對照組

AS組

卡維地洛組

正常對照組

AS組

卡維地洛組

2.615-LO表達的半定量分析 15-LO的陽性表達用面密度表示：AS組(1.247±0.071)與正常對照組(0.058±0.008)、卡維地洛組(0.148±0.017)比較，動脈內膜15-LO的表達明顯升高(P<0.001)；卡維地洛組與正常對照組比較， 15-LO的表達也有所升高(P<0.05)。

3 討 論

AS的發病機制是復雜的病理過程，與多種因素有關，近年來損傷-反應學說和由此發展而來的炎癥理論較為全面地解釋了粥樣斑塊的形成過程,得到較為廣泛的認可。脂質的氧化和對內皮細胞的損傷，以及脂質沉積的長期刺激導致泡沫細胞形成和平滑肌細胞增殖在AS的發生發展中起到重要作用，同時近年研究發現,參與粥樣斑塊形成過程的細胞和分子與參與炎癥反應的細胞和分子相同,從而炎癥理論得到了發展和完善〔2〕。目前認為動脈粥樣斑塊從發生發展到轉歸的全過程就是一個慢性炎癥過程，多種炎性因子、生長因子等在粥樣斑塊形成中起重要作用〔3〕。

本實驗參照郭延松等〔4〕的實驗方法建立大鼠AS的模型，結果顯示卡維地洛具有明顯的抗AS作用，又有明顯的抗氧化作用。炎癥因子TNF-α是ICAM表達的強效誘導劑，加速了AS的發生和發展過程。臨床試驗也發現高脂血癥、冠心病患者血清有較高水平的TNF-α，并與冠心病的危險性增加及AS的嚴重性密切相關，故認為TNF-α是促使AS發展的主要細胞因子〔5〕。本實驗表示在AS形成過程中TNF-α起到一定作用；卡維地洛能夠通過抑制炎癥因子TNF-α的表達而起到抗AS的作用。

15-LO是一種非鐵血紅素氧化酶，在人體內不僅可以氧化游離多不飽和脂肪酸，更可直接氧化復雜底物，除此之外，還有人發現，純化15-LO可在體外氧化人的LDL，因此被認為與AS中LDL的氧化密切相關〔6〕。其后的研究發現，在人和兔的AS斑塊中活性15-LO蛋白、mRNA與巨噬細胞以及oxLDL并存〔7〕。并有大量動物實驗顯示，15-LO的活性增高或過表達可加速早期AS的發生，而抑制15-LO及其產物的活性則可顯著延緩動脈粥樣癥的發生與發展,這都表明15-LO的高表達在AS中有重要作用〔8〕。本研究說明在AS形成中15-LO表達明顯增高，即卡維地洛明顯抑制了15-LO的表達，由此說明，卡維地洛通過抑制15-LO的表達而達到其抗氧化的作用。除此之外，還有文獻報道，15-LO氧化脂質的產物15-羥基二十碳四烯酸能夠通過增加內皮細胞ICAM-1的表達來促進單核細胞的黏附〔9〕。

4 參考文獻

1Ponnuswamy P,Schrottle A,Ostermeier E,etal.eNOS protects from atherosclerosis despite relevant superoxide production by the enzyme in apoE mice〔J〕.PLoS One,2012;7(1):e30193.

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3Libby P.Inflammation in atherosclerosis〔J〕.Nature,2002；420(6917):868-74.

4郭延松,吳宗貴,楊軍柯,等.三種大鼠動脈粥樣硬化模型復制方法的比較〔J〕.中國動脈硬化雜志,2003;11(5):465-9.

5Zhang H,Park Y,Wu J,etal.Role of TNF-α in vascular dysfunction〔J〕.Clin Sci(Lond),2009；226(3):219-30.

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