殼寡糖對S180荷瘤鼠P53、Bcl-2蛋白表達的影響

官 杰 興桂華 莊旭東 王 琪

(齊齊哈爾醫學院免疫教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

幾丁質又名殼多糖、甲殼質，廣泛存在于昆蟲、甲殼類動物外骨骼和真菌細胞壁及一些綠藻中，是由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成的多糖。幾丁質經脫乙酰化處理后得到殼聚糖。海洋殼聚糖是一種由β-1,4-糖苷鍵連接而成的多糖，進一步解聚可以生成水溶性殼寡糖，后者具有多種生物活性。近十幾年來，殼聚糖的研究已在國內外廣泛展開，它們具有免疫調節、抗腫瘤及降血脂等功能，但由于其不溶于水，在開發應用上受到很大限制。殼寡糖不但水溶性好，易被人體吸收，還展現出獨特優越的多種生理功能，主要表現在：能夠調節動物腸道內微生物代謝活動，選擇的活化有益菌，促進雙歧桿菌生長〔1〕；促進抗體生成、抑制腫瘤生長〔2,3〕；降低血壓、血糖、吸附膽固醇；活化植物細胞、促進植物細胞快速增長〔4〕等。其抗腫瘤作用主要是通過直接抑制細胞增生、誘導細胞壞死和凋亡、影響腫瘤血管生成和遷移、增強機體免疫力實現的。本文以S180荷瘤鼠作為研究對象，通過體內實驗，觀察殼寡糖對腫瘤細胞的誘導凋亡作用，探討殼寡糖抗腫瘤作用機制,為殼寡糖臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑、動物及儀器 殼寡糖由哈爾濱工業大學提供；環磷酰胺由上海華聯制藥有限公司生產；P53單抗、Bcl-2單抗免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；S180瘤株，由哈爾濱醫科大學免疫教研室提供，昆明小鼠，雌雄各半，質量18～22 g，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1實驗方法 取腹腔接種S180瘤株10 d的荷瘤小鼠，在無菌條件下抽取腹水，放入無菌容器內，置冰塊保存。用0.4%臺盼藍生理鹽水液計數(其活細胞>95%)。用生理鹽水調細胞濃度至1×108/ml，備用。取昆明小鼠(雌雄各半)30只，將其隨機分為模型組、殼寡糖組(15 mg/ml)、環磷酰胺(CY)組，每組10只。各組均造模，每只小鼠右腋下皮下注射0.2 ml瘤細胞懸液制備動物模型。模型組用生理鹽水腹腔注射，每天0.02 ml/g；殼寡糖組用殼寡糖(15 mg/ml)給小鼠腹腔注射，每天0.02 ml/g；CY組于小鼠腹腔注射CY，每天20 mg/kg。各組小鼠均于接種后次日給藥，給藥1次/d，連續10 d。

1.2.2免疫組織化學技術檢測P53、Bcl-2蛋白表達 脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織，10%甲醛固定，常規處理，石蠟包埋，連續組織切片4～6 μm，二甲苯脫蠟至水。免疫組化染色采用兩步法，其步驟嚴格按照試劑盒要求進行。染色結果判定：Bcl-2和P53染色陽性標志為棕黃色顆粒，Bcl-2主要表達在細胞核或胞質，P53主要表達在胞質。光鏡高倍鏡觀察，隨機選擇10個視野，計算1 000個細胞的陽性細胞數。

2 結 果

2.1各組小鼠P53表達水平 與模型組(60.2±7.4)比較，殼寡糖組(46.5±6.9)和CY組(48.2±3.5)瘤組織中P53表達水平降低(P<0.05)；殼寡糖組與CY組比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.2各組間小鼠Bcl-2表達水平測定 與模型組(73.6±8.0)比較，殼寡糖組(43.2±9.5)和環磷酰胺組(42.6±8.8)瘤組織中Bcl-2基因表達水平均降低(P<0.05)；殼寡糖組與CY組比較，兩者無顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組小鼠P53表達水平(IH，×400)

圖2 各組小鼠Bcl-2表達水平(IH，×400)

3 討 論

在醫藥領域，殼寡糖主要用于抗腫瘤、抗感染、降低血清膽固醇等作用。在抗腫瘤方面，殼寡糖對小鼠S180肉瘤有明顯的抑制作用并能提高促凋亡基因Bax的表達，降低抑凋亡基因Bcl-2的表達〔5〕。殼寡糖還能提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力〔6〕。本課題前期工作結果：殼寡糖可抑制腫瘤生長〔7〕，提高機體免疫功能，同時殼寡糖可誘導腫瘤細胞凋亡〔8〕。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡，又稱程序性細胞死亡(PCD)。腫瘤的發生、發展不僅是細胞增殖和分化的異常，而且也與腫瘤細胞凋亡的失控密切相關。P53作為一種抑癌基因具有抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤細胞增殖的作用。Bcl-2 作為一種原癌基因無論是在生理和腫瘤形成的情況下, 均可以通過抑制細胞凋亡而促進增殖細胞的惡性轉化和腫瘤細胞的生長, 從而干預腫瘤的發生發展。本實驗結果說明殼寡糖能夠有效調節腫瘤組織P53、Bcl-2的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，延緩了腫瘤發生的進程。

本實驗從P53、Bcl-2局部提示殼寡糖可影響腫瘤細胞的基因水平，而腫瘤是多基因異常所致疾病，殼寡糖抑制腫瘤生長在基因水平的作用是對上述基因特異的作用，或是對多種癌基因和抑癌基因非特異作用有待進一步研究。

4 參考文獻

1竺國芳,趙魯杭.幾丁寡糖和殼寡糖的研究進展〔J〕.中國海洋藥物,2000;19(1):43-6.

2Feng J,Zhao L,Yu Q.Receptor-mediated stimulatory effect of oligochitosam in macrophages〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,2004;317(2):414-20.

3吳海明，華曉陽，何登全.殼寡糖抗腫瘤作用及免疫調節機制的研究〔J〕.中華醫學研究雜志，2005;5(8)：729-32.

4胡志鵬.殼寡糖的研究進展〔J〕.中國生化藥物雜志，2003;24(4)：210.

5劉清華,孔慶兗,柳 紅. 殼寡糖對S180肉瘤細胞凋亡、細胞周期以及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的影響〔J〕.徐州醫學院學報，2006;26(4)：290-3.

6曹秀明，徐海嬌，尚 明，等.殼寡糖抗腫瘤和免疫調節作用的實驗研究〔J〕.哈爾濱商業大學學報(自然科學版)，2006;22(4):8-10.

7官 杰,羅曉慶，王 瑛，等.殼寡糖抑制腫瘤作用的實驗研究〔J〕.中國免疫學雜志,2007;23(5):421-5.

8官 杰,王 琪,王 慧,等.殼寡糖對荷瘤鼠腫瘤細胞凋亡的影響〔J〕.免疫學雜志,2009;25(2):195-7.