LINE-1核酸內切酶變異體GCRG213在人正常胃黏膜的表達

廉宏偉 李 杰 王衛華 段曉劍 王剛石

(中國人民解放軍總醫院南樓消化科，北京 100853)

胃癌相關基因213(GCRG213)是由本實驗室通過比較人胃竇部低分化腺癌、癌旁和正常胃黏膜組織的基因表達，采取應用熒光標記的mRNA差異顯示技術，篩選出的一條胃癌組織高表達基因序列〔1〕。已有研究〔2,3〕證明GCRG213是有功能的LINE-1中核酸內切酶(EN)的變異體。免疫組織化學分析顯示，GCRG213蛋白在胃癌細胞的胞質中呈現陽性信號，而在胃癌病變切緣的非癌變組織中，黏膜層的被覆上皮表達均為陰性〔3〕。近期研究發現，GCRG213蛋白在正常胃黏膜的部分固有腺體細胞呈陽性表達。本研究擬進一步探討GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達特征。

1 資料與方法

1.1材料和對象 試劑： 3%過氧化氫、檸檬酸修復液(pH=6.0)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.2～7.4)、即用型山羊抗鼠免疫組化試劑盒、二氯基聯苯胺(DAB)顯色液、中性樹膠等購自北京中杉金橋生物技術有限公司。鼠抗人GCRG213單克隆抗體由解放軍總醫院南樓消化科實驗室制備并保存。蘇木素染色液，1%鹽酸酒精，0.5%伊紅染色液，二甲苯、不同濃度酒精均為本實驗室配制。儀器：高溫烤箱(重慶萬達)，微波爐(日立)，顯微鏡(奧林巴斯，BX60)

人正常胃黏膜組織共97例，標本取自解放軍總醫院手術切除的胃標本或胃鏡活檢標本，所有的組織均通過10%的多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，蠟塊行4 μm連續切片，室溫保存。

1.2方法

1.2.1實驗方法 蘇木素-伊紅(HE)染色 將組織切片放置80℃烤箱內烤20 min，放入二甲苯脫蠟，乙醇濃度逐級遞減進行水化，蘇木素染液浸染5 min，流水沖洗5 s，1%鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗10 min，1%伊紅染液1 min，流水沖洗數秒，酒精由低至高濃度逐級脫水，置二甲苯透明，用中性樹膠封片。

免疫組化染色 常規脫蠟并水化(步驟同上)；PBS洗3次，5 min/次，加3%過氧化氫12 min去除內源性過氧化物酶；PBS洗3次，5 min/次,檸檬酸(pH=6.0)修復液高火煮沸后加入組織切片，中低火微波12 min，室溫冷卻約40 min；PBS洗3次，5 min/次，加GCRG213鼠抗人單克隆抗體(稀釋比例1∶1 000)，4℃冰箱過夜；次日PBS洗3次，5 min/次，加聚合物輔助劑孵育15 min，PBS洗3次，5 min/次,加辣根酶標記抗小鼠IgG多聚體(小鼠超敏試劑盒PV9002)15 min; PBS洗3次，5 min/次,滴加DAB顯色，清水終止染色，常規脫水、透明、封片(步驟同上)。實驗陰性對照采用PBS代替一抗，陽性對照采用人胃癌組織作為實驗標本。

GCRG213蛋白在胃黏膜腺體細胞表達陽性的判斷：陽性信號為細胞質呈淡黃色-深棕黃色。本實驗中97例胃黏膜主細胞都有表達，用顏色深淺表示表達強度：淺黃色為低度表達，淺棕色為中度表達，深棕黃色為高度表達。

1.2.2統計學方法 應用SPSS17.0軟件采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達 采用無胃部基礎疾病的人正常胃黏膜標本進行免疫組化分析，結果顯示GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的部分固有腺體有陽性表達信號。顯微鏡下清晰可見在細胞的胞質內呈均勻或顆粒狀的淺黃色-深棕黃色信號，該陽性信號以靠近黏膜下層的固有腺體尤為明顯，而在近胃腔側的固有腺體中陽性信號逐漸減弱，至黏膜被覆上皮則呈陰性(圖1)。進一步觀察黏膜固有層GCRG213蛋白陽性表達的腺體，發現僅部分細胞的胞漿表達陽性，結合HE染色結果，明確GCRG213蛋白陽性表達的細胞均為主細胞(如圖1中箭頭①所示)，HE染色觀察該細胞呈柱狀，細胞核圓形，位于細胞的底部，胞質嗜堿性很強，染成紫藍色。固有腺體中GCRG213蛋白陰性表達的細胞為壁細胞(如圖1中箭頭②所示)，該細胞體積比較大，呈圓形或三角形，細胞核呈圓形，位于細胞中央，細胞質強嗜酸性，HE染色呈紅色。表面黏液細胞和頸黏液細胞主要位于胃黏膜的表面和頸部，細胞呈柱狀或燒瓶狀，細胞核呈扁圓形，位于基底部，胞質染色較淺，GCRG213蛋白在這兩種黏液細胞的表達也呈陰性(如圖1中箭頭③、④所示)。

2.2GCRG213蛋白表達與患者基本特征之間的關系 收集97例人正常胃黏膜組織，年齡27～84歲，平均57歲，免疫組化發現胃固有腺體的主細胞胞漿均可見GCRG213蛋白表達，進一步分析其表達強度與患者年齡、性別、吸煙史和飲酒史的關系。在男性患者中，GCRG213蛋白呈低度或中度表達的比例略高于女性；在老年組中，該蛋白呈低度和高度表達的比例略高；在吸煙和飲酒患者中，此蛋白呈中度表達的患者比例均高于未吸煙飲酒患者。上述各參數進行組間和組內比較差異不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 GCRG213蛋白在人正常胃黏膜的表達〔n(%)〕

A：GCRG213蛋白在正常人胃黏膜的表達(×100，IHC)；B：與A同一組織連續切片的HE染色(×100，HE)；C、D分別為A，B固有腺體中同一區域的放大圖(×400)；圖中箭頭所指①為主細胞；②為壁細胞。E、F分別為A、B胃黏膜表面同一區域的放大圖(×400)，圖中箭頭所指③為表面黏液細胞④頸黏液細胞

3 討 論

本研究發現GCRG213表達陽性的細胞主要是胃黏膜近黏膜下層的固有腺體中的主細胞，表達部位在胞質。主細胞是胃固有腺體中的主要細胞，位于腺體基底部，數目最多，這種細胞分泌胃蛋白酶原(PG)，故又稱胃酶原細胞。胃蛋白酶是胃中唯一的一種蛋白水解酶，以PG顆粒形式分泌，經胃液中鹽酸激活后，具有消化蛋白質的能力。但是GCRG213蛋白在同一腺體的壁細胞中則表達陰性，壁細胞主要是由胃黏膜腺體峽部的干細胞增殖分化形成〔4〕，主要分泌鹽酸，又稱泌酸細胞。正常情況下，這兩種細胞通過調節胃酸的分泌，共同保護胃黏膜屏障。PG為胃蛋白酶沒有活性的前體，目前根據其生化性質和免疫原性將其分為PGI(PGA)、PGⅡ(PGC)兩個亞群，有文獻〔5〕報道PGC是胃黏膜主細胞的標志物分子，其在胃黏膜的主細胞特異性表達，并采用PGC基因的啟動子，實現Cre重組酶在主細胞的特異性表達。本文發現GCRG213蛋白在胃黏膜主細胞高表達，故推測該蛋白表達與主細胞的功能有關，可能與主細胞分泌的PG也存在一定關系。一般認為在低酸環境下，PG更多被激活轉變為具有活性的胃蛋白酶，使其水解蛋白質的能力增強，這樣就有可能削弱胃黏膜的屏障功能，導致消化性潰瘍甚至癌變的發生，也有文獻〔6〕報道胃蛋白酶是胃癌發生發展的腫瘤標志物。然而在同一腺體中，分泌鹽酸的壁細胞中GCGR213蛋白則呈陰性表達，此外該蛋白在胃黏膜被覆上皮的表面黏液細胞也呈陰性表達，這提示GCRG213可能與胃酸的分泌和黏液的分泌無必然相關性。有文獻〔7〕報道PG的產生不僅局限在胃底腺，還有胃竇的黏液細胞和近端十二指腸的Brunner腺體，同時前列腺和胰腺也可產生，GCRG213在其他組織腺體的表達情況需要進一步研究證實。

隨著年齡增長，老年人胃黏膜發生萎縮性改變，固有腺體減少并且變得稀薄，主細胞隨之較少，Majumdar等〔8〕通過電子顯微鏡發現，老齡鼠的超微結構發生退化性改變；Maitra等〔9〕證明老齡鼠的PG濃度較非老齡鼠的低；有研究報道〔10〕發現老齡鼠的胃蛋白酶活力較非老齡鼠的低；同時有學者報道〔11,12〕隨著年齡增長，胃蛋白酶的mRNA水平下降。以上諸多研究證明主細胞的功能隨著年齡的增長而慢慢退化。本研究未發現GCRG213蛋白表達在老年組和非老年組之間存在差異，說明該蛋白在主細胞中的表達并不隨著年齡的增長而發生改變，另一方面，本研究選取的標本是組織學觀察正常的胃黏膜腺體，沒有分析老年人常見的胃黏膜腺體萎縮狀態下GCRG213蛋白的變化，值得進一步研究。

GCRG213是長散布核元件(LINE-1)的核酸內切酶的變異體，LINE-1是人類基因組中最豐富自主轉座的非末端重復序列反轉錄轉座子，其活動可能導致腫瘤的發生。LINE-1有2個讀碼框，分別是ORF1和ORF2〔13〕，ORF2編碼的蛋白具有核酸內切酶(EN)和逆轉錄酶(RT)活性〔14〕，GCRG213-ORF編碼的氨基酸序列與LINE-1的EN高度同源〔3〕。有文獻〔15〕報道GCRG213正義轉染可促進腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞的成瘤性，并通過免疫印跡方法發現，抗GCRG213蛋白的抗體可以與胃癌SGC-7901細胞蛋白特異結合，但與胃上皮HFE-145細胞蛋白無特異性結合，說明GCRG213抗體具有一定的腫瘤特異性〔16〕。有研究〔17,18〕報道主細胞分泌的PG水平在胃炎、胃潰瘍、胃癌病變中逐漸降低，其可作為一個癌變指標，本文發現GCRG213蛋白在主細胞高表達，結合其在胃癌細胞也呈高表達，設想胃癌細胞與主細胞是否來源同一個生發中心，這為研究胃癌的發生提供了一條新思路。

綜上，GCRG213蛋白在人胃黏膜主細胞特異性表達，但未發現其在患者中的隨齡改變。推測該蛋白表達可能與主細胞功能有關，具體機制需要更多研究證明。該蛋白在萎縮性胃炎和胃潰瘍等胃部疾病及其他部位如腸道、肝臟、胰腺等的表達情況將在下一步實驗中研究。

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