不同飲食結構建立的2型糖尿病腎病大鼠模型比較

芝 敏 梁新華 徐佩茹

(新疆醫科大學第一附屬醫院腎病科，新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病合并高血壓的模型目前多采用的是SHR高血壓大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，但缺陷是先有高血壓，然后才出現糖尿病，不符合臨床糖尿病患者出現高血壓的自然病程。研究〔1,2〕表明，高血壓是導致糖尿病腎病腎損傷加重的重要因素，即便在微量白蛋白尿期，合并高血壓的糖尿病腎病患者的腎病進展速度也要明顯快于未合并高血壓者。本研究通過對高糖高脂飼料及高鹽高脂飼料兩種不同飼料喂養+單腎切除+STZ腹腔注射制作的2型糖尿病腎病大鼠模型的比較，旨在探索更合理的2型糖尿病腎病的造模方式。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8周齡SD雄性大鼠36只(由新疆醫科大學動物實驗中心提供)，體重(170±30)g，于新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心飼養，12 h周期節律，自由攝食水。

1.2飼料、試劑、儀器 高脂高糖飼料(10%蔗糖， 3%蛋黃粉，10%豬油，77%普通飼料)，高脂高鹽飼料(10%豬油，5%氯化鈉，3%蛋黃粉，82%普通飼料)，由新疆醫科大學動物實驗中心進行加工。STZ購自Sigma公司，胰島素試劑盒購自北京北方生物研究所。

1.3造模方法 隨機分成三組，每組12只，先用普通飼料適應性喂養1 w后，測定血壓、血糖，確定基線無差異(P>0.05)，禁食12 h，將氯胺酮(100 mg/2 ml)、 地西泮(10 mg/2 ml)、 阿托品各1支(0.5 mg/ml)混合后，用生理鹽水稀釋至10 ml， 再按0.75 ml/100 g體重計算用量，給予腹腔麻醉，在背部肋脊角下方脊柱旁開2 cm，切開皮膚及肌肉、腹膜，找出腎臟，沿腎門結扎后，切除左腎，縫合肌肉及皮膚。術后開始分別給予高鹽高脂(A)組、高糖高脂(B)組及正常飼料(C)組喂養。4 w后給予內眥取血測空腹血清胰島素，恢復2 d后禁食12 h，按20 mg/kg給予STZ，使用前用0.1 mol/L pH4.2檸檬酸緩沖液配制成1%STZ溶液，間斷3次腹腔注射(每次間隔2 d)，C組給予腹腔注射檸檬酸緩沖液。STZ腹腔注射72 h后尾尖測血糖≥16.7 mmol/L，即為糖尿病造模成功，繼續分別給予上述飼料喂養12 w。

1.4鼠尾動脈血壓檢測 使用成都泰盟科技有限公司的NIBP-1A無創血壓測定分析系統進行鼠尾動脈血壓檢測。預熱儀器，把大鼠用固定盒固定，暴露鼠尾安裝調試好壓力感受器，放入恒溫箱中30 min，待大鼠安靜且波形穩定后測量，每只記錄3次，取均數為此次血壓的測定值，每4 w測1次。

1.5生化及一般指標檢測 STZ注射后72 h大鼠尾尖采血并用拜安捷血糖儀檢測血糖。各組大鼠每2 w給予稱體重，并測空腹血糖。16 w后禁食，代謝籠留取24 h尿測定尿微量白蛋白后，稱體重，腹腔麻醉下開腹，腹主動脈采血，3 000 r/min離心5 min后取血清，Beckman全自動生化儀進行血脂、血糖、腎功、離子、白蛋白的檢測，同時摘取右腎，稱重并記錄重量，計算腎重/體重，切取一半腎組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片行HE及Masson染色，同時切取米粒大小腎組織于戊二醛中固定，送電鏡檢查。

1.6病理檢測并計算腎小球硬化指數 每片選取20個完整的包括血管極及尿極的腎小球，根據Raij等〔3〕的半定量方法評估腎小球硬化程度，根據腎小球硬化灶占腎小球比例分為5級(腎小球無病變為0級，腎小球損傷不足25%為1級，損傷26%～50%為2級，51%～75%為3級，76%～100%為4級)，計算腎小球硬化指數。每張標本低倍鏡下隨機觀察5個腎小管間質視野，依據文獻〔4〕作為腎小管間質損傷指數的評分指標，以5個視野評分均值表示腎小管間質損傷指數。

1.7統計方法 使用SPSS13.0版統計學分析軟件對數據進行方差分析和q檢驗。

2 結 果

2.1大鼠的成模情況及胰島素抵抗情況 STZ腹腔注射后大鼠出現多飲、多食、多尿、消瘦、毛發枯黃，A組死亡2只，B組死亡1只，B組在實驗過程中2只出現牙周感染。A組空腹胰島素(39.73±12.71)mIU/ml，B組(51.81±16.98)mIU/ml，C組(21.84±9.84)mIU/ml，3組有統計學差異(F=9.996，P=0.001)。A組與B組無明顯差異，而兩組與C組均有統計學差異，提示產生了胰島素抵抗。

2.23組大鼠不同時期血壓比較 3組血壓基線水平一致，不同飲食喂養后第4周起A組雖出現了血壓升高，但無統計學意義(P>0.05)，第8周A、B組血壓也高于C組，A組在第12周時血壓水平最高，到第16周血壓較12 w血壓略有回落。B組16 w的血壓與基線水平無明顯差異，而A組16 w血壓則明顯高于起始點水平。見表1。

2.33組大鼠各種生化指標的對比 除肌酐外，A、B組指標與C組均有統計學差異，其中A組的24 h尿微量白蛋白、腎指數高于B組，而總膽固醇的指標A組則低于B組(P均<0.05)。見表2。

表1 3組大鼠不同時間收縮壓變化

表2 各組大鼠生化指標的差異

2.43組大鼠光鏡下及電鏡下病理改變 3組腎小球直徑有統計學差異(P<0.05)，A、B兩組腎小球〔(112.67±8.13)μm;(107.64±9.2)μm〕較C組〔(86.14±4.65)μm〕明顯肥大，但A、B兩組無統計學差異。8只A組大鼠可見腎小管內蛋白管型，7只可見腎小動脈管壁增厚，A、B兩組大鼠均可見腎小管上皮細胞空泡變性，電鏡下A、B兩組與C組比較均可見足突廣泛融合甚至消失，基底膜局灶性增厚，系膜區基質增多，系膜細胞增生，部分可見腎小管內細胞器增多。見圖1～3。腎小球硬化指數及腎小管間質損傷指數見表3。

表3 各組腎小球硬化指數及腎小管間質損傷指數對比

圖1 不同組大鼠腎臟病理改變(HE,×400)

圖2 不同組大鼠腎臟纖維化情況(Masson，×200)

a:基底膜呈不規則增厚，并有足突融合及消失；b：系膜細胞增生及系膜區增寬

3 討 論

糖尿病合并高血壓的患病率在20%～50%左右，已有充分的證據表明，高血壓參與了糖尿病腎病的發病，且加速了糖尿病腎病的進展〔1，2〕。孫兆峰等〔5〕使用高鹽高脂飲食+STZ注射建立了2型糖尿病伴高血壓大鼠的模型，明確了高鹽高脂飼料喂養可以誘導出大鼠的胰島素抵抗及高血壓，但對其對腎臟的損害未進行探討。Catherine等〔6〕在給STZ誘導的糖尿病大鼠不同濃度的(1%與3%)高鹽飲食后發現并未產生明顯的高血壓，也未產生明顯的腎臟損害，并發現高鹽飲食后反而明顯減輕了糖尿病腎病的高濾過，并認為可能是由于高鹽飲食使致密斑的Na+濃度正常化，進而減少了腎素的分泌。研究表明，當鹽含量達到4%～5%或8%時，可以誘導出糖尿病合并高血壓的大鼠模型〔7〕。本研究提示：①在一定范圍內增加糖尿病大鼠飲食中的鹽含量，并不能誘導出高血壓，相反還可以降低糖尿病腎病早期的高濾過，也不會造成腎小球的損害，超過了一定限度后，血壓會出現升高，并引起腎損害的加重，這可能與高鹽飲食在一定程度降低了體內醛固酮的水平有關。②高鹽高脂飲食較單純的高鹽飲食可能更易誘導出糖尿病大鼠模型鹽敏感性高血壓的形成。③單腎切除的糖尿病大鼠具有更明顯的腎臟高灌注、高濾過、高壓力，因此更易誘導出鹽敏感性高血壓的發生及腎臟損傷的加重。

綜上，高鹽飲食能誘發糖尿病腎病大鼠更加明顯的高血壓，同時加重微量白蛋白尿，因而可能更適合做2型糖尿病合并高血壓的腎病動物模型。

4 參考文獻

1Bidani AK，Picken M，Hicioglu R，etal.Spontaneously reduced blood pressure load in the rat streptozotocin-induced diabetes model:potential pathogenetic relevance〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2007;292:F647-54.

2Glassock RJ，Cohen AH，Adler S.Primary glomerular diseases〔M〕.In:Brenner BM ed. The kidney.Philadelphia:PA.W.B.Saunders,1994：630-6.

3Raij L, Azar S, Keane W. Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats〔J〕.Kidney Int，1984；26:137-43.

4Radford MG，Donadio JV，Bergstralh EJ，etal.Predicting renal outcome in IgA nephropathy〔J〕.J AM Soc Nephrol,1997；8:199-207.

5孫兆峰，王 利，張 玲,等.伴高血壓2型糖尿病大鼠模型的建立〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(9)：1078-80.

6Catherine L,Ian S,Michael T,etal.Salt-resistant blood pressure and salt-sensitive renal autoregulation in chronic streptozotocin diabetes〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009;296：1761-70.

7Orie NN, Aloamaka CP, Iyawe VI. Enhanced sensitivity to salt-induced high blood pressure in diabetes mellitus〔J〕. Res Exp Med (Berl),1994;194:197-202.