VEGF、LYVE-1在肝癌組織中的表達與意義

趙建龍 王胐胐 李世朋 席守民 李文雅 丁雪貞

(河南科技大學醫學院，河南 洛陽 471003)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，侵襲力強而易發生轉移，而且手術治療后復發率較高。肝癌的侵襲轉移是個復雜多步驟過程，與肝癌細胞的浸潤、新生血管形成和淋巴道轉移等有關。近些年來血管內皮生長因子VEGF在肝癌血管生成和進展中的作用被廣泛研究〔1〕。LYVE-1是淋巴管壁透明質酸的主要受體，且是腫瘤組織淋巴管形成的特異標志〔2〕。而LYVE-1在肝癌的侵襲轉移方面的研究甚少，故本文采用免疫組織化學法檢測VEGF、LYVE-1在肝癌組織中表達及探討兩者的相關性，為肝癌的血道轉移和淋巴道轉移的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1組織標本 收集解放軍一五零中心醫院2006年6月至2011年8月接受肝癌手術治療患者術后存檔的石蠟標本32例，癌旁組織23例與正常肝臟存檔石蠟標本19例，所有病例均有完整臨床資料。

1.2主要試劑 一抗兔抗人VEGF、兔抗人LYVE-1(美國BIOSS生產)，二步法免疫組化試劑盒(SP-0023)產自美國ZYMED公司，均購自北京博奧森生物技術有限公司。DAB顯色試劑盒(AR-0612)購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3方法 采用免疫組化并嚴格按照二步法免疫組化試劑盒操作說明書進行染色。每例蠟塊4 μm 厚連續切片3張，其中1張進行HE 染色，另 2張進行免疫組化染色。一抗體工作液濃度均為 1∶150。石蠟切片常規脫蠟、水化，微波爐抗原熱修復，加封閉血清，最后進行DAB顯色，顯微鏡下控制，自來水沖洗終止反應，蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗。然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判斷標準 用試劑盒中的陽性片作為陽性對照，PBS取代一抗作為陰性對照。細胞質(膜)染色呈棕黃色視為陽性；對其表達判斷的染色強度和陽性細胞百分率的得分之和進行評估。染色強度：無染色為0分；弱陽性為1分；中等陽性為2分；為強陽性為3分。陽性細胞百分率：無陽性細胞為0分；陽性細胞數<25%為1分；陽性細胞數25%～50%為2分；陽性細胞數50%～75%為3分；陽性細胞數>75%為4分。兩項之和：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4分為()；5～7分為()。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0統計軟件。樣本率的比較采用χ2和Fisher檢驗，相關性分析采用Spearman 相關檢驗。

2 結 果

VEGF、LYVE-1染色主要存在于細胞質，細胞膜亦有部分染色，見圖1、圖2。VEGF在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織和肝臟正常組織(P<0.05)，見表1。LYVE-1在肝癌組織和癌旁組織中的陽性率顯著高于正常肝組織，且癌旁組織中的陽性率最高(P<0.05)，見表2。VEGF、LYVE-1在低未分化肝癌中的陽性率明顯高于高中分化者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中VEGF與LYVE-1的表達水平分別比I～Ⅱ期高(P<0.05)；有淋巴結轉移肝癌中的陽性率明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)，見表3。蛋白在肝癌中的表達存在高度相關性(r=0.383，P=0.03)。

表1 VEGF在不同肝臟組織中的表達(n)

表2 LYVE-1在不同肝臟組織中的表達(n)

表3 肝癌中VEGF、LYVE-1陽性表達與臨床病理學參數的關系〔n(%)〕

圖1 VEGF在不同肝臟組織中的表達(DAB，×200)

圖2 LYVE-1在不同肝臟組織中的表達(DAB，×200)

3 討 論

目前國內外有研究顯示，惡性腫瘤的生長、浸潤和轉移依賴于腫瘤血管生成，VEGF能通過旁分泌形式特異性作用于血管內皮細胞，通過促進內皮細胞增殖、增加血管通透性，以誘導腫瘤血管生成，在腫瘤的發生發展中起關鍵作用〔3～5〕。研究發現肝癌組織中VEGF的表達水平高于癌旁肝組織，并且在肝癌組織中VEGF的表達與靜脈侵襲有關〔6〕。Park等〔7〕發現在正常肝細胞和肝癌細胞中都有VEGF的表達，而且隨著肝癌組織血管形成的逐步發展，VEGF的表達程度也逐漸增加。本文結果表明VEGF是一種增加血管通透性并促進新血管生長的細胞因子，在肝癌組織中呈高表達并與侵襲轉移和預后等生物學行為關系密切，與腫瘤及腫瘤轉移灶的生長中的血管生成有關〔8，9〕。

目前大量研究表明淋巴管轉移在腫瘤轉移過程中起重要作用，而腫瘤淋巴管浸潤的發生是淋巴結轉移的前提。LYVE-1是Banerji等〔10〕于1999年在尋找與CD44(已明確的HA受體)相關的受體時，發現的一種新的受體，被認為是目前特異性最強的淋巴管內皮標志物之一。LYVE-1絕大多數只特異性地表達在淋巴管內皮細胞上，均勻分布于淋巴管內皮細胞的基底面和胞腔面〔10〕。它還可分布于肝臟血竇內皮細胞內〔11〕，而在血管內皮細胞上很少表達〔12〕。本文本文結果采用配對資料的檢驗計算推測VEGF和LYVE-1在肝癌發生發展、侵襲、轉移尤其是淋巴轉移過程中存在協同作用。

4 參考文獻

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10Banerji S,Ni J,Wang SX,etal.LYVE-1，Bnewhomologue of the CD44 glycopmtein,is a lymph-specific receptor for hyaluronan〔J〕.J Cell Biol,1999；144(4):789-801.

11Mouta C,Nas ser SM,di Tomaso E,etal.LVYE-1 is not restricted to the lymph vessels：expression in nonnal liver bloodsinu soids and do wnregulation in hum an 1iver cancer and cirrhosis〔J〕.Cancer Res,2001； 61 (22):8079-84.

12王 艷,朱 波,陳正堂,等.LYVE-1在腫瘤淋巴管生成領域的研究〔J〕.生命的化學2005；25(4)：314-6.