灰樹花多糖聯合順鉑對H22肝癌移植瘤小鼠的抑瘤作用研究

呂冬霞 杜 偉 范曉艷 王曉麗 李 玉

(佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖(PGF)是從優質灰樹花子實體中提取的有效活性成分，研究表明PGF具有抗腫瘤作用〔1，2〕。本研究采用免疫組化法檢測半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3，Caspase-8，細胞色素C(Cytc)在PGF聯合順鉑誘導H22腫瘤細胞凋亡過程中的變化，觀察PGF聯合順鉑對腫瘤生長的影響，探討其抑瘤作用機制和細胞凋亡通路。

1 材料與方法

1.1材料 瘤株：H22肝癌細胞購于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院動物中心；實驗動物：昆明種近交系雄性小鼠，體重(20±2.0)g，佳木斯大學實驗動物中心提供，許可證號：黑動字第99101001，普通級，普通環境飼養。PGF粉末：浙江方格藥業有限公司，多糖含量為90%。順鉑粉劑：山東齊魯制藥廠。Caspase-3，Caspase-8，Cytc抗體：南京基美生物。SP-9001試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒：北京中杉金橋。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 取昆明種近交系小鼠40只，分別接種1×107/ml細胞懸液于右側腋下，隨機分成四組，每組10只。

1.2.2實驗分組及給藥方式 用生理鹽水溶解順鉑和PGF。接種24 h后開始給藥。給藥時間：每日早上進行灌胃1次，晚上進行腹腔注射1次，間隔時間12 h，連續給藥14 d。具體給藥方法見表1。

表1 實驗動物的給藥種類、方式與用量

1.2.3皮下腫瘤生長實驗 實驗結束后，觀察腫瘤狀態，完整剝取腫瘤后測量移植瘤質量和體積。平均瘤體積=(a × b2)/ 2 (a、 b分別為腫瘤長徑和短徑)。q 值= E(A+ B )/ EA + EB(1-EA)〔EA、 EB 、 E(A+ B)分別為PGF組、 順鉑組及聯合組的抑瘤率〕根據q值判斷聯合用藥的療效，q<0.85為拮抗，q值0.85～1.15為相加，q>1.15為協同。

1.2.4Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達檢測 采用SP法進行免疫組化操作。分別觀察制片后的Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達，Caspase-3為細胞膜和細胞質著色，Caspase-8和Cytc為細胞漿著色，著色成棕黃色或褐色的是陽性細胞。顯微鏡下選取每個區域不重復隨機10個高倍視野(×400)，觀察所選擇視野中的所有細胞，記錄陽性染色細胞百分數并計分。

評分標準如下：IHS=A×B。A為陽性細胞數分級0～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B為陽性細胞顯色強度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)。對所得數值進行完全隨機設計兩樣本均數比較t檢驗。

2 結 果

2.1皮下腫瘤生長實驗 接種后，小鼠成瘤率100% ，在第1～3天，各組移植瘤生長情況基本相同；第4～14天，對照組移植瘤生長快于其他組，聯合組腫瘤生長最慢；解剖可見腫瘤質硬，表面有血管生長分布。從平均瘤塊體積來看，用藥組瘤塊體積低于對照組(P<0.05，P<0.01)；與聯合組比較，PGF組、順鉑組均有差異(P<0.05)，而對照組有顯著性差異(P<0.01)。各組平均瘤塊體積、瘤質量及抑瘤率，見表2。

表2 各組平均瘤質量及瘤塊體積

2.2單獨及聯合治療對H22肝癌移植瘤細胞Caspase-3、Caspase-8、Cytc表達影響 見表3。與對照組比較，順鉑組與PGF組Caspase-3，Caspase-8，Cytc的陽性率差別有統計意義(P<0.05)；與聯合組比較，對照組差別有顯著統計學意義(P<0.01)，各單藥組差別有統計學意義(P<0.05)。

表3 小鼠移植瘤Caspase-3，Caspase-8，Cytc蛋白表達

3 討 論

順鉑是目前臨床上治療腫瘤最常用和較有效的化療藥物之一，大量或較長期使用，容易產生毒副作用、多藥耐藥性。本研究表明PGF和順鉑聯合體內抗腫瘤具有相加作用，說明PGF可通過增加順鉑對癌細胞的敏感性而增強抗癌作用。

誘導細胞凋亡的因素很多，這些因素都需要激活不同的Caspase家族成員，才能導致細胞凋亡，故Caspase被認為是細胞凋亡的核心執行者即凋亡的共同通路〔3，4〕。Caspase-3屬于效應Caspase〔5〕,是多數細胞凋亡途徑中的末端效應蛋白酶。Caspase-8是死亡受體介導的凋亡途徑中關鍵的啟動因子，細胞凋亡依賴一類對Caspase產生的級聯反應，能夠通過自身切割活化，激活下游Caspase，產生凋亡效應〔6，7〕。Cytc是一種可溶性多肽，定位于膜間隙，并與線粒體內膜疏松結合。近來，有一系列的研究表明，Cytc是通過和dATP與Apaf1及Caspase-9結合，從而活化Caspase-3而起作用〔8〕。

綜上，順鉑、PGF、聯合組既通過死亡受體途徑又通過線粒體途徑誘導H22腫瘤細胞凋亡，且PGF可通過增加順鉑對癌細胞的敏感性而增強抗癌作用。

4 參考文獻

1杜景衛，夏作理，李清初，等.灰樹花多糖抗S180肉瘤的實驗研究〔J〕.泰山醫學院學報，2005；25(2):195-7.

2呂冬霞，杜 偉,范曉艷,等.灰樹花多糖聯合順鉑對H22荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡的影響〔J〕.黑龍江醫藥科學，2011；34(3):72.

3Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998；18(11):6353-64.

4Rao RV,Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001；276(36):33869-74.

5Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，etal.Identification and inhibition of the ICE/ CED - 3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕 .Nature，1995；376(6535):37-43.

6Zhang W，Shi HY，Zhang M.Maspin overexpression modulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins〔J〕.BMC Cancer，2005；5(1)：50.

7Werner AB，Vries E，Tait SW，etal.Bcl-2 family member Bfl-1/A1 sequesters truncated bid to inhibit its collaboration with pro-apoptotic Bak or Bax〔J〕.J Biol Chem，2002；277(25)：22781-8.

8Li P ，Nijhawan D ，Budihardjo I，etal.Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/ caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade〔J〕.Cell，1997；91(4):497-89.