天麻素預處理對短暫性腦缺血大鼠腦組織S100β表達的影響

趙朝華 吳樹強 楊 杰 茍興春 張軍鋒 楊吉平 史利利

(西安醫學院基礎醫學研究所，陜西 西安 710021)

研究發現天麻素具有擴張腦血管、提高腦細胞抗缺氧能力、減小腦缺血后梗死體積，抑制細胞凋亡等神經保護作用〔1〕。腦缺血再灌注損傷過程非常復雜，而此損傷發生后 S100β在腦內表達和血清中濃度的改變不僅是腦缺血損傷的重要病理學指標〔2〕，而且其表達量的多少顯著影響腦缺血損傷的發展和轉歸。缺血再灌注后過表達的S100β蛋白對中樞神經系統有毒性作用〔3〕，可加重腦損傷。而天麻素對腦缺血再灌注后S100β的表達有何影響并未見較為系統研究報道。因此，本實驗采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞再灌注模型來明確天麻素對S100β的表達的影響，進一步探討天麻素的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠由西安交通大學醫學院動物中心提供，鼠齡8～12 w，體重240～280 g，實驗前常規環境分籠飼養至少7 d。天麻素組(n=4)于造模前3 d每日腹腔注射天麻素注射液(中山市三才醫藥有限公司)100 mg/kg 1次，對照組(n=4)注射等體積生理鹽水。參考Longa等〔4〕描述的管腔內線栓技術閉塞右側大腦中動脈(MACO)誘導建立暫時性局部腦缺血大鼠模型。簡要過程：大鼠做頸部前正中切口，分離暴露右側頸部血管，用微動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內動脈，將一頭端加熱呈光滑球形的3-0尼龍線(寧波醫用縫線廠)經頸外動脈插入頸內動脈至感到有輕微阻力為止，進線長約18 mm左右。栓塞2 h后輕輕抽出尼龍線至頸外動脈切口處。手術期間使用電熱毯維持大鼠體溫在36.5～37.5℃。常規環境下飼養。大鼠分別存活1、3和7 d。

1.2方法

1.2.1神經功能學評價 MCAO后2 h參照文獻〔5〕方法進行神經功能損傷程度的評定，即0級：行為正常；1級：提尾懸空左側前肢屈曲，肩內收；2級：抵抗對側推力下降，伴前肢屈曲；3級：自發性側向旋轉運動，伴抵抗對側推力下降和前肢屈曲。評定為3級者視為成功腦缺血模型，用于后續實驗。

1.2.2S100β免疫組織化學染色 各組于缺血后1、3和7 d分別取大鼠4只，常規灌注固定，斷頭取腦，石蠟包埋、切片(片厚8 μm)，用于S100β免疫組化染色(S100β單克隆抗體和SABC二抗試劑盒均購自武漢Boster公司)。

1.2.3細胞計數 每只大鼠取4張切片，在20倍物鏡下通過Motic Images Advanced 3.0 圖像分析系統在缺血邊緣區選取4個等面積視野區，計數S100β陽性細胞(胞體完整，呈棕色或棕黑色)數，結果平均后即為1張腦片的S100β陽性細胞數。

1.2.4血清S100β含量測定 動物處死前，均經右心室取血1.5 ml,分離血清，-20℃凍存。所得血清通過ELISA檢測S100β含量。操作按試劑盒(第四軍醫大學生理教研室提供)說明進行。S100β單克隆抗體和S100β多克隆抗體均由自武漢Boster公司提供。

2 結 果

2.1缺血邊緣區S100β陽性細胞的形態、數目變化 免疫組織化學染色顯示，對照組腦缺血再灌注后1 d S100β陽性細胞在缺血中心區基本消失，偶見形態不完整似將裂解的細胞胞體輪廓，而在缺血邊緣區出現許多胞體肥大呈圓形的S100β陽性細胞(20.01±3.87)。天麻素組S100β陽性細胞(16.16±3.59)明顯少于對照組(圖1)。3 d時對照組為(31.43±3.01)，3 d時缺血邊緣區可見大量肥大的S100β陽性細胞，突起增多，數目明顯增加(24.39±2.86，圖1)。S100β陽性細胞計數結果顯示腦缺血再灌注后1 d S100β陽性細胞數目天麻素組均少于對照組(24.39±2.86,P<0.05)。

2.2血清S100β的含量變化 對照組大鼠腦缺血后1 d時血清S100β含量顯著升高(正常大鼠血清S100β含量本實驗未能測出)，ELISA檢測值為(9.12±1.65)μg/L，3 d明顯降低，測定值為(2.83±0.98)μg/L，較1 d時有顯著性差異(P<0.05)。天麻素組血清S100β含量1 d亦明顯增高，檢測值為：(6.76±1.97)μg/L，3 d為(1.49±0.88)μg/L。天麻素組的S100β含量均顯著低于缺血組(P<0.05)。

對照組1 d

天麻素組1 d

對照組3 d

天麻素組3 d

3 討 論

腦缺血缺氧可刺激星形膠質細胞活化，產生更多的S100β〔6〕，加上從損傷的膠質細胞漏出的S100β〔7〕，在缺血邊緣區將存在高濃度(在μmol范圍)的S100β，而高濃度S100β具有神經毒性，可升高神經元內鈣離子的濃度，引起鈣超載，誘導培養的(AS)表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，并進而生成NO，導致(AS)和培養的神經元死亡〔8〕。高表達的S100β還能促進小膠質細胞分泌白細胞介素(IL)-1，IL-1又能強烈刺激AS活化和增殖，產生大量的S100β〔9〕。S100β自身也能促進AS肥大增殖，產生更多的S100β蛋白，這是一個復雜的鏈條，S100β在這個復雜的過程中扮演主要角色。大量的動物實驗研究表明可能通過以上機制過表達的S100β加重了腦缺血損傷后神經功能缺失及遲發性梗死灶的擴展〔10～12〕。Mori等〔3〕應用高表達S100β的轉基因大鼠研究發現，高表達S100β的大鼠較對照組腦梗死體積顯著增加，神經功能損傷嚴重，缺血半暗帶膠質瘢痕過度增生。從而更加證實了S100β過表達對腦缺血后神經毒害作用。

本實驗結果提示天麻素可能在缺血再灌注早期對S100β的表達有抑制作用。從而可能抑制或減少由于腦缺血損傷后S100β蛋白含量的升高而使腦組織進一步損傷。這可能是天麻素對腦缺血損傷保護作用的另一重要途徑。但是具體天麻素如何作用于星形膠質細胞抑制S100β在腦缺血再灌注早期的過表達還有待進一步研究。

4 參考文獻

1楊 杰，趙朝華，宗長宏，等.短暫性 MCAO大鼠注射天麻素具有神經保護作用〔J〕.第四軍醫大學學報，2008；29(4)：295-6.

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