絲膠對2型糖尿病大鼠坐骨神經神經微絲蛋白表達的影響

李 健 鐘美蓉 宋成軍 王小杰 陳志宏

(承德市中心醫院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

糖尿病截肢患者幾乎都存在周圍神經病變，病程20年的糖尿病患者，神經病變的發病率約為60%，且隨病程延長有逐漸增加的趨勢〔1〕。當前，多以控制血糖并輔助營養神經及活血化瘀等藥物治療糖尿病周圍神經病變。在臨床上多用西藥控制血糖，但西藥的不良反應不容忽視。前期研究發現，絲膠(彩色蠶繭水提取物)可明顯降低血糖和調節血脂代謝紊亂，保護糖尿病胰島細胞損傷和性腺功能障礙〔2～4〕。本研究觀察糖尿病模型大鼠坐骨神經神經微絲蛋白(NFP)表達的變化，探討絲膠對2型糖尿病周圍神經損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；小鼠抗NFP多克隆抗體，美國Santa Cruz公司，購自武漢博士德生物工程有限公司。絲膠為彩色蠶繭經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫學院蠶業研究所提供。

1.2實驗動物及分組 3月齡清潔級雄性SD大鼠36只，體重200～250 g(合格證號：712024)，由河北醫科大學實驗動物中心提供。隨機選取12只為正常對照組，常規飼養，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(PH 4.4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液)3次(1次/d)；其余的24只大鼠小劑量STZ連續腹腔注射(2% STZ，25 mg/kg，3 d)建立2型糖尿病動物模型，7d后以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準〔5〕；然后再隨機分為糖尿病模型組和絲膠治療組，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常對照組、模型組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水35 d。

1.3檢測血糖 各組大鼠用藥結束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，眶后靜脈叢采血，3 000 r/min離心20 min后取血清，應用全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4檢測坐骨神經NFP的表達 大鼠取血后斷頭處死，于膝關節上方取長約4 cm的坐骨神經干，入Bouins液固定，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm。SP免疫組織化學染色檢測坐骨神經NFP的表達。小鼠抗NFP一抗稀釋濃度1∶50，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，以坐骨神經軸索中出現棕黃色顆粒為NFP陽性反應。采用MiVnt圖像分析系統進行定量分析：每張切片于10×20倍顯微鏡下選取3個視野，計算免疫陽性產物面積占視野面積的比值，每只大鼠選取6張切片，每組隨機選取6只大鼠，取平均值作為NFP的相對表達水平。

1.5統計學方法 應用SPSS15.0統計學軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠的血糖表達 糖尿病模型大鼠的血糖明顯高于正常對照組大鼠(P<0.01)；絲膠治療組大鼠的血糖明顯高于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的血糖和坐骨神經NFP的表達

2.2各組大鼠坐骨神經NFP的表達 NFP免疫陽性產物為棕黃色，位于坐骨神經的軸索。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠坐骨神經NFP的表達明顯降低(P<0.01)；絲膠治療組大鼠坐骨神經NFP的表達明顯高于糖尿病模型組大鼠(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠坐骨神經NFP的表達(免疫組化染色，×200)

3 討 論

糖尿病屬中國傳統醫學“消渴癥”范疇，糖尿病周圍神經病變在糖尿病的基礎上發展而來，以臟腑陰虛燥熱、氣陰兩虛、津液疏布失常為基礎，隨著病程的延長，日久導致癖血阻滯經絡，出現肢體疼痛、麻木等諸多表現。蠶繭，蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，具有滋陰潤燥、生精止渴作用，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。

糖是機體重要的能量來源之一，正常穩態的血糖可保證能量代謝的需要，血糖過高會引起一系列的病理生理變化。大量研究已經證實，高血糖不但可導致糖尿病，還會降低機體對胰島素的敏感性〔6〕。研究表明，長期血糖控制不佳與糖尿病周圍神經病變的發生密切相關；而有效控制血糖，可以預防、延緩糖尿病周圍神經病變的發生與進展〔1，7〕。

NFP是神經元細胞骨架的主要組成部分，是反應神經元和突觸功能狀況的內在標志物之一，在維持神經細胞正常形態和軸漿運輸方面具有至關重要的作用。細胞骨架是細胞質內的非膜性細胞器，由微管、微絲和中間絲等組成，神經元中的中間絲主要為NFP。NFP除形成細胞骨架起支持作用外，還有研究發現，細胞內98%有活性的多聚核糖體與NFP有關。以細胞松弛素D處理細胞，可使多聚核糖體脫落，同時蛋白質合成停止，說明NFP與DNA的轉錄和翻譯有關，并參與軸漿運輸〔8〕。軸漿運輸不僅為神經元的新陳代謝提供物質基礎，還參與神經系統中的分子信息傳遞以及物質交換，對神經元正常結構和功能的維持具有重要意義〔9〕。研究表明，糖尿病時存在明顯的骨架蛋白基因的改變〔10〕。Scott等〔10〕的研究發現，糖尿病時NFP的表達可下降26%～46%，并伴有有髓神經纖維和無髓神經纖維中NFP陽性纖維及微管數量和密度的下降，以及無髓神經纖維的萎縮。NFP表達的減少可導致神經元的物質合成、遷移和細胞內物質轉運過程出現障礙，致使神經系統的功能活動無法正常維持。

4 參考文獻

1Callaghan BC,Little AA,Feldman EL,etal.Enhanced glucose control for preventing and treating diabetic neuropathy 〔J〕.Cochrane Database Syst Rev,2012;6: CD007543.

2付秀美，鐘美蓉，陳志宏，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(1)：103-5.

3宋成軍，付文亮，陳志宏.絲膠預處理對2型糖尿病大鼠睪丸生殖細胞的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(13)：2459-61.

4付秀美，馬洪偉，陳志宏，等.絲膠對Ⅱ型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用〔J〕.解剖學雜志，2010；33(2)：161-4.

5向雪松，王 竹，祝宇銘，等.鏈脲佐菌素注射劑量對建立2型糖尿病大鼠模型的影響〔J〕. 衛生研究，2010；39(2)：138-42.

6Biarnes M,Montolio M,Nacher V,etal.Beta-cell death and mass in syngeneically transplanted islets exposed to short- and long-term hyperglycemia〔J〕.Diabetes,2002;51(1):66-72.

7Fujita Y,Fukushima M,Suzuki H,etal.Short-term intensive glycemic control improves vibratory sensation in type 2 diabetes 〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,2008;80(1):e16-9.

8Ackerley S,James PA,Kalli A,etal.A mutation in the small heat-shock protein HSPB1 leading to distal hereditary motor neuronopathy disrupts neurofilament assembly and the axonal transport of specific cellular cargoes 〔J〕.Hum Mol Genet,2006;15(2):347-54.

9Zochodne DW,Sun HS,Cheng C,etal.Accelerated diabetic neuropathy in axons without neurofilaments 〔J〕.Brain,2004;127(Pt 10):2193-200.

10Scott JN,Clark AW,Zochodne DW.Neurofilament and tubulin gene expression in progressive experimental diabetes: failure of synthesis and export by sensory neurons〔J〕.Brain,1999;122(Pt11) :2109-18.