點陣CO2激光對光老化大鼠皮膚抗氧化指標的影響

黃茂芳 鄧景航 朱慧蘭 楊慧蘭 劉仲榮

(廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510090)

由于長期的日光照射，主要是紫外線輻射可導致皮膚光老化〔1〕。隨著激光技術的發展，點陣激光可以應用于光老化的治療。為探討其治療機制，本文就應用點陣CO2激光處理光老化Wistar大鼠皮膚，觀察光老化大鼠在外觀、組織學及抗氧化指標丙二醛(MDA)/超氧化物歧化酶(SOD)方面的變化，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠37只，體重200～250 g，由中山大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)2009-0011]。

1.2分組 27只Wistar大鼠制備光老化模型，15只造模成功。隨機選取10只造模成功的大鼠為實驗組，10只未經處理的Wistar大鼠隨機成為對照組。兩組分別做自身對照，分成實驗1組(A1)、實驗2組(A2)、對照1組(B1)、對照2組(B2)。兩組大鼠精神狀態良好，活潑，進食正常。

1.3實驗試劑與儀器 MDA測定試劑盒、SOD測試盒(南京建成生物工程研究所)，儀器：紫外線光療儀 SS-03A型、紫外線幅照度監視計(上海希格瑪高技術公司)，紫外線光療儀UV801KL(Waldman公司)，超級酶標儀(Bio Rad，MXLEL 680)，點陣CO2激光機(UltraPulse Encore TM Lumenis，美國)。

1.4實驗方法 將實驗組大鼠固定于自制的大鼠固定器中，遮蓋其眼睛與頭部，暴露背部裸露皮膚。造模方法與判斷標準見文獻〔2〕。實驗動物備皮后，以低能量點陣CO2激光(能量：波長10 600 nm，光斑大小4×4 mm2，光點0.125 mm，能量125 mJ/cm2，連續脈沖數1)，照射實驗2組與對照2組背部；高能量CO2激光(能量參數同，連續脈沖數4，即能量600 mJ/cm2)照射實驗1組與對照1組。各組分別于治療后1 d、1、2、3、4 w后取材觀察相關指標變化。

1.5觀察指標 (1)大鼠一般情況，體重、進食、精神狀態等。每天觀察大鼠的進食、精神狀態。(2)大鼠暴露部位皮膚肉眼觀。觀察內容：整個實驗期間，每天觀察動物背部皮膚有無紅斑、水泡、糜爛、結痂等。觀察皮膚粗糙程度、皮膚彈性狀態、皺紋變化等。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察皮膚組織病理學切片 動物稱重后以10%水合氯醛按0.3 ml/100 g計算麻醉藥物量，腹腔注射麻醉后，實驗組每只切取約0.5×0.5 cm2的皮膚組織各4塊。

1.7皮膚組織氧化與抗氧化指標測定 按說明書，分別用相應的測定試劑盒脂質過氧化產物MDA、SOD的測定。

2 結 果

2.1大鼠暴露部位皮膚肉眼觀 激光照射1 w后全部治療組結痂脫落。實驗組光老化的皮膚肉眼觀發生了迅速變化，1 w后，原光老化的皮膚外觀就明顯減輕，但皮膚的彈性恢復仍較慢。見圖1。

2.2HE染色組織學檢查結果 隨著激光治療時間的延長，新生的膠原從真皮中層開始向兩端深部擴散。其中實驗組的光老化組織學表現逐漸改善，紊亂、僵硬的膠原纖維逐漸改善，而對照組新生膠原不斷增加。見圖2。

正常大鼠

光老化大鼠

實驗組治療第1天

對照組治療第1天

對照組治療第4周

實驗組治療第4周

正常大鼠皮膚(×40)

光老化皮膚(×100)

A1組第2周(×40)

A1組第2周(×100)

B1組第2周(×40)

B1組第2周(×100)

A1組第4周(×100)

A1組第4周(×200)

B1組第4周(×40)

B1組第4周(×200)

2.3MDA檢測結果 見表1。從時間與分組因素來考慮，各組均數存在統計學差異(P<0.001)，且存在交互效應(F=274.602，P<0.001)。對A1組、A2組均數進行重復測量方差分析顯示，Mauchly球型檢驗示：Mauchly W值為0.125，采用Greenhouse-Geisser校正；A1組與A2組均數存在統計學差異。用pairwise comparisons進行多重比較顯示，各組均數之間的P<0.001。對B1組、B2組均數進行重復測量方差分析顯示，Mauchly球型檢驗示：Mauchly W值為0.421，P=0.117，滿足球型檢驗；B1組與B2組均數沒有統計學差異。用pairwise comparisons進行多重比較顯示，第1周B組均數與第2周B組均數沒有統計學差異(P=0.773)，第3周B1組均數與第4周B1組均數沒有統計差異(P=0.624)，其余組之間比較均顯示P<0.05。

2.4各組SOD檢測結果 見表2。從時間與分組因素來考慮，各組均數存在統計學差異(P<0.001)，且存在交互效應(F=313.430，P<0.001)。

對A1組、A2組均數進行重復測量方差分析顯示，Mauchly球型檢驗示：Mauchly W值為0.346，采用Greenhouse-Geisser校正；A1組與A2組均數存在統計學差異。用pairwise comparisons進行多重比較顯示，第3周A組與第4周A組均數統計學意義(P=0.952)，其余各組均數之間的P<0.001。

對B1組、B2組均數進行重復測量方差分析顯示，Mauchly球型檢驗示：Mauchly W 值為0.454，P=0.166，滿足球型檢驗；B1組與B2組均數不存在統計學差異。用pairwise comparisons進行多重比較顯示，第1天B組均數與第3周B組均數統計學差異(P=0.133)，第1周B組均數與第2周B組均數統計差異(P=0.607)，第3周B組均數與第4周B組均數沒有統計學意義(P=0.078)，其余組之間比較均顯示P<0.05。

第4周A1組與B1組均數沒有統計學差異。A2組與B2組均數也統計學差異(P>0.05)。

表1 實驗期間治療組MDA含量變化

表2 實驗期間治療組SOD含量變化

3 討 論

點陣激光可以治療光老化，但目前的研究主要集中在治療臨床經驗的總結，用點陣CO2激光治療光老化Wistar大鼠，從微觀組織結構、分子生物學等方面去探討點陣激光的治療機制。從外觀上看，在點陣CO2激光治療1次的情況下，無論是接受了高能量還是較低能量的大鼠皮膚，在短短的1 w時間內，痂皮脫落后都表現出明顯的改善，包括皺紋、皸裂、色素沉著消失，皮膚彈性改善明顯，說明點陣CO2激光治療光老化的效果快速。點陣CO2激光治療中導致皮膚出現點陣分布的凹陷性瘢痕，3 w后都全部消失，說明這種治療方法副作用小。從激光的作用能量來看，高能量與低能量激光治療的肉眼觀的效果類似，只是高能量治療后皮膚結痂多些，脫落時間稍長于低能量治療組。

以皮膚組織學切片觀察光老化的微觀變化是比較客觀的評價標準。以時間段來觀察光老化組織學的改變，點陣CO2激光作用于皮膚后，短時間(1 d)內引起組織內炎癥，主要是表皮和真皮乳頭層的炎性細胞浸潤，可見確實存在組織創傷(無菌性炎癥)。但炎癥1 w左右的時間就能消失。組織炎癥后的修復重建同時開始，1 w的組織切片上就看到有成纖維細胞的增生，有多少不等的新生膠原纖維出現，以后逐漸增多。組織的修復不僅是新生膠原的出現，看到原先大量僵硬的、聚集成束的纖維逐漸軟化、散開。一方面是膠原的增生，一方面是膠原的重排和重組，這可能是激光照射后組織吸收熱量，與熱誘導的熱效應有關。并且，激光作用的部位比較集中。組織吸收能量后，出現局灶性的一過性表皮、真皮乳頭層炎癥反應，真皮層出現多個局灶性的裂隙，圍繞著裂隙周圍，結締組織疏松，包括膠原間疏松、水腫，而且它們集中在真皮中層，同時可以見到一些間雜有光老化部位的改變卻不明顯。說明激光的能量作用很集中，接收到能量照射的部位，早期就出現組織學改變，而沒有照射到微小激光束的部位自然改變不多；同時，微小點陣激光束作用到的能量焦點，主要在真皮中層。隨時間的延長，新生的膠原逐漸向呈帶狀修復，可覆蓋到原先未被激光束所照射的光老化區，進而引起皮膚全面的修復重建。點陣CO2激光治療光老化的效果得到組織學上的證實。

活性氧簇(ROS)在皮膚光老化的發病機制中扮演重要的角色〔3〕，常用的氧化及抗氧化指標，如MDA、SOD等,以MDA/SOD的變化〔4〕來評價激光治療效果。本研究中對照組雖然是正常皮膚，沒有光老化的病理狀態，但在作用的早期，激光引起皮膚組織局灶性的炎癥、水腫，這些都是共同的創傷早期表現，可以引起暫時性的氧化應激狀態，導致一過性的MDA升高，而適度的氧化應激狀態可以誘導SOD的表達。隨著修復重建的進行，正常皮膚組織中氧化應激狀態的解除，MDA與SOD都出現下降，回歸至正常水平。因此，皮膚過氧化指標MDA以及抗氧化指標SOD比較靈敏，能夠反映早期治療效果以及恢復水平，同時不同能量對皮膚組織中MDA/SOD影響有差異。本研究顯示，點陣CO2激光有扭轉過氧化狀態的作用，因此能夠治療光老化。并且這個作用與能量有一定的相關性。分析其中可能的機制是：在一定能量密度下，激光穿透皮膚形成微治療區(MTZ)〔5〕，就是在組織切片上看到的裂隙區，微治療區周圍的組織疏松，血氧的滲透，有利于清除光老化條件下組織間堆積的脂質過氧化物；有可能激光產生的生物效應激活了大量的細胞及炎癥因子，促進SOD的分泌及MDA的清除。

綜上，本實驗從大體觀、微觀組織結構方面證實了點陣CO2激光治療光老化的效果。氧化與抗氧化等生化指標可以作為反映早期治療效果以及恢復水平的參考指標之一。

4 參考文獻

1劉 瑋.皮膚光老化〔J〕.臨床皮膚科雜志，2003;32(7): 424-6.

2郭魯義，李春雨，張 寧，等. 實用光老化動物模型建立方法的探討〔J〕. 中國美容醫學，2008;17(2)：235-7.

3Berneburg M,Plettenberg H,Medve-Konig K,etal. Induction of the photoaging associated mitochondrial common deletion in vivo in normal human skin〔J〕. J Invest Dermatol,2004;122(5): 1277-83.

4Gilchrest BA. Skin aging and photoaging：an overview〔J〕. J Am Acad Dermatol,1989;21(32):610-3.

5Starnes AM,Jou PC,Molitoris JK,etal. Acute effects of fractional laser on photo-aged skin〔J〕. Dermatol Surg,2012;38(1):51-7.