SHP-1基因在多發性骨髓瘤中的表達及意義

李 燕 羅建民 袁 軍 王素云 李 杰 楊 潔 王瑞倉 郝洪嶺 王 超 韓 穎

(河北省人民醫院血液科，河北 石家莊 050000)

SHP-1基因是近年來發現的抑癌基因之一，是眾多蛋白酪氨酸激酶之一，是細胞信號轉導中關鍵的負調控因子，調節細胞內的磷酸化水平,前期實驗〔1〕證實SHP-1基因在急性白血病中發揮抑癌基因的作用。多發性骨髓瘤是常見的惡性血液病，目前有關SHP-1基因與多發性骨髓瘤關系的研究國內尚無詳細報道。本研究旨在探討SHP-1基因在多發性骨髓瘤發病中的作用及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象 2007年3月至2010年3月我院血液內科住院和門診隨訪的患者69例，所有患者均符合張之南主編的血液病診斷中多發性骨髓瘤的診斷標準〔2〕，并采用Durie-Salmon(1982年)分期標準。男43例，女26例,發病年齡45～81歲，中位年齡63歲,好發年齡55～70歲,>55歲有58例(84%)。其中初治組69例，其中Ⅰ期35例、Ⅱ期21例、Ⅲ期13例；IgG 32例、IgA 18例、IgD 5例、輕鏈型11例、不分泌型3例。根據2011年NCCN多發性骨髓瘤治療指南中的EBMT標準定義的治療療效，經過治療后，其中完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、輕微緩解(MR),共計42例，無治療反應(NC)25例，死亡2例。

1.2治療方案 69例患者中,MP治療組12例,具體為馬法蘭6 mg/d，第1～7天、潑尼松1～1.5 mg·m-2·d-1第1～7天，4 w為1療程。M2治療組15例,具體為卡氮芥125 mg，第1天,環磷酰胺600 mg·m-2·d-1第1天,長春新堿2 mg，第1天，馬法蘭6 mg/d，第1～7天、潑尼松1 mg/kg，第1～7天，5 w為1療程。VAD治療組31例,具體為長春新堿0.5 mg/d，第1～4天、阿霉素10 mg·m-2·d-1，第1～4 天、地塞米松20 mg/d,第1～4天、第9～12天、第17～20天，4 w為1療程。硼替佐米聯合化療組11例,硼替佐米劑量為1.0～1.3 mg/m2,第1、4、8、11天，3 w為1療程,與地塞米松或馬法蘭、潑尼松聯合化療。

1.3分組 將研究對象分為初治組(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)、CR+PR+MR組、NC組、正常對照組。觀察各組中SHP-1基因的表達情況，將初治組分別根據SHP-1 mRNA的表達與否分為陽性組與陰性組，觀察兩者陽性組、陰性組與緩解率的關系。

1.4檢測方法

1.4.1材料 Ficoll 淋巴細胞分離液、M-MLV 、Taq DNA 聚合酶、dNTP、隨機六聚體引物均購自Promega公司，Trizol 試劑購自Solarbio 公司。引物由北京賽百盛有限公司合成，SHP-1 的擴增片段長度238 bp，上游引物：5′-GCGGCAGTACTATGC-3′,下游引物：5′-CAGTTCCAACACTCGGTT CTCA-3′。GADPH的擴增片段長度358 bp，上游引物：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAA TGG-3′下游引物：5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG- 3′。

1.4.2RT-PCR方法檢測SHP-1基因的表達 病例組及對照組均采集新鮮骨髓液4 ml，以100 U/ml的肝素抗凝。用TRI-REAGENT提取患者和健康對照組總RNA。逆轉錄反應體系20 μl，包括細胞總RNA 1 μg，在37℃中反應60 min，95℃反應5 min后終止反應。PCR反應體系為25 μl，包括逆cDNA 1 μl，MgCl21.5 mmol/L,200 μl的4種dNTP，0.5 μmol/L的引物，1.5 U的Taq酶。以GADPH作為內參對照。取10 μl擴增產物，1 g/100 ml瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，溴乙啶染色，紫外投射儀上觀察結果并照相。RT-PCR擴增條件見表1。

表1 RT-PCR擴增條件

1.5統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行兩個獨立樣本的非參數檢驗和χ2檢驗。

2 結 果

2.1SHP-1 mRNA的表達 所有正常人均能檢測到SHP-1 mRNA表達，表達水平為3.309±2.610，用同一實驗條件檢測69例多發性骨髓瘤患者SHP-1 mRNA，初治組陽性率為42 %，表達水平為0.165±0.132，PR+CR+MR組表達陽性率為59.5%,表達水平為0.608±0.253，NC組表達陽性率為16%，表達水平為0.158±0.121，初治、治療無反應組多發性骨髓瘤患者中SHP-1表達陽性率與表達水平明顯低于正常對照組(P<0.01)。緩解后的SHP-1 mRNA的表達升高，但低于正常對照組(P<0.01)。見圖1。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期多發性骨髓瘤之間SHP-1 mRNA的表達水平比較無統計學意義(0.169±0.119，0.154±0.124，0.172±0.153,P>0.05)。

1～3：正常對照組；4～6：完全緩解、Ⅰ期與無治療反應患者組

2.2SHP-1 基因的表達與臨床療效的關系 SHP-1基因與多發性骨髓瘤患者治療反應有明顯的相關性，SHP-1 基因陽性組緩解率(86.2%)明顯高于表達陰性組(44.7%)(P<0.01)，其中表達陽性患者中，有治療反應的25例，總有效率為86.2%，明顯高于表達陰性的患者的治療有效率(P<0.01)。

3 討 論

SHP-1基因主要表達在造血細胞，被稱為造血細胞磷酸酶(HCP)。SHP-1磷酸酶是細胞信號傳導中關鍵的負調控因子，調節細胞內的磷酸化水平，經研究發現各種白血病、惡性淋巴瘤細胞株中SHP-1 mRNA和SHP-1蛋白水平的下降，其原因在于SHP-1啟動區的甲基化或SHP-1蛋白合成轉錄后阻滯。相反，SHP-1蛋白在非淋巴細胞株中可以表現為正常表達或過度表達。SHP-1位于胞質，與細胞激活、增生、分化和轉化等有關，SHP-1主要通過影響生長因子受體、細胞因子受體和免疫反應相關受體的活性而發揮作用，從而抑制細胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負相關〔3〕。目前SHP-1在多發性的骨髓瘤的作用機制尚不明確，可能通過影響其他的調控因子發揮作用，故需要下一步實驗證實。

目前已分離純化的蛋白酪氨酸磷酸酶有40多個，構成PTPs家族，SHP-1屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。人類SHP-1基因定位于12號染色體的p12-p13區,含17個外顯子，全長17 kb〔4〕，外顯子3、4， 5、6，8、10分別編碼N-末端的SH2域，C- 末端的SH2域和催化功能區。SHP-1蛋白為68 kD的非跨膜酪氨酸磷酸酶，含兩個SH2結構域，一個催化片段和約100個氨基酸殘基的C-末端， SHP-1位于胞質，與細胞激活、增生、分化和轉化等有關，SHP-1主要通過影響生長因子受體、細胞因子受體和免疫反應相關受體的活性而發揮作用，從而抑制細胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負相關〔5〕。

總之，SHP-1不僅參與了白血病的發病，而且在多發性骨髓瘤中也發揮了負性調節作用，它的表達降低或缺失影響著多發性骨髓瘤的發生發展，并為多發性骨髓瘤的治療中提供理論依據及靶向治療。

4 參考文獻

1韓 穎，羅建民，賈曉輝，等.急性白血病患者SHP-1與C-kit基因表達及其臨床意義〔J〕.中國實驗血液學雜志，2006；14(5)：871.

2張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標準〔M〕.第2版.北京：科學出版社，1998:373-80.

3Hsu HC,Shultz LD,SU X,etal.Mutation of the hematopoietic cell phosphatase (Hcph) gene is associated with resistance to γ-irradiation induced apoptosis in Src homology protein tyrosine phosphatase(SHP)-1-deficient “Motheaten” mutant mice〔J〕.J Immunol,2001；166:772-80.

4Tsui HW,Hasselblatt K,Martin A,etal.Molecular mechanisms underlying SHP-1 gene expression〔J〕.Eur J Biochem,2002；269(12):3057-64.

5Jones PA, Baylin SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer〔J〕.Nat Rev Genet，2002；3(6)：415-28.