胃癌患者轉化生長因子β1、β2和 β3蛋白的表達水平與預后因素和存活率的相關性

牟衛平 蘇世輝 曹 璋

(濱州醫學院附屬醫院消化內科，山東 濱州 256603)

胃癌患者的預后與一些臨床和病理指標相關，主要包括腫瘤分期、組織類型、分化程度以及治療方法等。惡性腫瘤發生過程中，會出現生長因子和細胞因子表達異常，其與腫瘤的發生和預后更為密切；其中最為重要的是轉化生長因子(TGF)β〔1〕。TGFβ是一個大的蛋白家族中的成員，包括結構和功能相似的3個成員：TGFβ1、β2和β3〔2〕。體外試驗中這三個分子能夠通過抑制cyclin-依賴性激酶誘導正常細胞和一些惡性轉化的上皮細胞發生細胞生長周期停滯。TGFβ還可以通過失活突變、其相應受體的下調或TGFβ信號轉導通路的元件突變起到生長抑制效應。試驗表明在結直腸癌患者體內TGFβ1過表達〔3〕，在正常細胞中不表達TGFβ1蛋白和mRNA，還有研究發現胃癌患者TGFβ1的表達水平與腫瘤分期，預后效果有關，并且可以作為獨立預后因素〔4〕。本研究觀察TGFβ表達與其他典型預后影響因素和存活率的相關性。

1 研究對象和方法

1.1研究對象 我院2005年6月到2008年6月胃癌手術患者110例。納入標準：所有病例的存檔組織，病理記錄數據和臨床隨訪數據齊全。手術前沒有接受過化療和放療，手術方法包括全胃或部分胃切除，胃切除范圍依腫瘤位置而定。術后病理分級為以下幾類：R0切除(67例)，手術完全切除了腫瘤，在術后組織病理學檢驗邊緣組織中也沒有發現有腫瘤微轉移跡象， R1切除(31例)：手術中腫瘤完全切除，但在組織病理學檢驗中發現邊緣仍有微腫瘤灶殘余。R2切除(12例，病情緩解)：在手術切除的大體標本和病理鏡檢腫瘤在切除邊緣都有殘留。排除標準為：患者有其他重要器官的功能不全，有嚴重的感染，術后出現嚴重的并發癥(出血、吻合口瘺及胰瘺等)或者合并有其他部位的惡性腫瘤及切除時腫瘤已有廣泛的腹腔轉移。男71例，女39例，年齡25～72(中位數56)歲。見表1。隨訪期內76.2%(84/110)的病例存活。

表1 TGFβ1、β2和β3表達水平與不同病理學參數的關系

1.2研究方法 該試驗為盲法，病理醫生在觀察病理切除時并不了解相關臨床數據。有專人詳細記錄病理，進行檢查，驗證病理等級以及腫瘤分期。試驗中所有腫瘤均根據惡性腫瘤國際腫瘤分類標準(TNM)進行分期，其中中等或分化良好的腸道腺癌(根據Lauren分類標準)為低惡度腫瘤，而分化不佳的腸道腫瘤以及有擴散腺癌是高惡度腫瘤。術后隨訪3～42(中位數17)個月，觀察患者的生存率。

1.3免疫組化 將手術切除后的胃癌組織和正常非癌胃組織制作成4 μm厚的石蠟切片，進行免疫組化，檢測TGFβ1、β2和β3蛋白表達水平。對Ⅲ和Ⅳ期腫瘤患者還要對淋巴結轉移組織進行檢測，記錄原發位點和轉移病灶內的3種TGFβ表達水平的差異。將石蠟切片放在覆膠玻片上，使用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。使用1%過氧化氫處理15 min阻斷內源過氧化物酶。將玻片放在微波爐中高火處理5 min，重復兩次，進行抗原修復。使用標準抗生物素蛋白-生物素檢測技術(Multilinkkit;Biogenex,SanRamon,CA)檢測抗原。使用的抗體包括有抗TGFβ1、β2和β3的兔源多抗(均按1∶100稀釋；Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz,CA)。使用二氨基聯苯(Sigma Fast DAB tablets, D-4293,St. Louis, MO)作為顯色劑。使用Harris蘇木素進行復染。所有步驟均在室溫下進行。每步之間均要用PBS漂洗。使用小鼠卵巢切片(Santa Cruz,CA)作為TGFβ1的陽性對照，使用人胎盤組織作為TGFβ2的陽性對照，使用Paget患者的乳房組織作為的陽性對照。試驗使用正常兔血清代替一抗作為陰性對照。TGFβ1、β2和β3胞質著色則認為是陽性反應。標本中5%以上的腫瘤細胞出現TGFβ1、β2和β3的胞質著色則認為病例為陽性。

1.4形態學分析 在光學顯微鏡下對組織切片進行掃描，選擇陽性染色區域。使用10×10顯微鏡網格在400×放大倍數下進行細胞計數。在選中區域計數免疫染色陽性細胞和總細胞數(至少500個細胞)，每張切片要選擇5個不同的區域計數。每個區域腫瘤和非腫瘤胃組織中TGFβ1、β2和β3陽性細胞數除以總細胞數得到陽性細胞百分比。同一區域數值大于10%，數值沒有差異。然后計算平均得分。

1.5統計學處理 使用單變量方差分析(ANOVA)進行組間比較，評估病理學參數與染色結果之間的關系。如果不符合變量的方差相等或變量不呈正態分布，則使用Kruskal-Wallis非參數檢驗進行分析。使用Spearman秩相關系數檢驗TGFβ1、β2和β3之間的關系及 TGFβ2表達水平與患者存活時間之間的關系。使用Kaplan-Meier方法比較生存曲線。后者包括生存率和無病生存率。統計軟件為SPSS10.0。

2 結 果

2.1標本免疫組化染色的TGFβ1、β2和β3表達 TGFβ1主要在癌細胞胞質表達。有78例病例腫瘤中有TGFβ1的表達，而正常黏膜和上皮細胞沒有TGFβ1的表達。癌細胞中TGFβ2的表達水平明顯高于正常上皮細胞(P<0.01)，并且與腫瘤位置，分期和等級無關。正常黏膜和癌細胞中均有TGFβ3的表達。正常黏膜和癌細胞中TGFβ3的表達水平之間沒有統計學顯著差異(P>0.05)。所有腫瘤中均有TGFβ2和β3表達，在有淋巴結轉移的病例中均可檢出TGFβ1、β2和β3的表達。晚期腫瘤TGFβ2的表達水平更高(P=0.008)。但TGFβ1和β3并未顯示出這種變化趨勢。低惡度腫瘤中的TGFβ1表達水平更高(P=0.009)。見表1，圖1。腫瘤等級、位置與TGFβ2和β3的表達水平無關， Ⅲ期腫瘤患者TGFβ2和β3的表達水平之間存在直接關系(r= 0.610；P<0.01)，見圖2。

2.2TGFβ1、β2和β3表達水平和臨床治療結果之間的關系 TGFβ1的表達能提高患者的無病存活率(圖3；P<0.05)和總體存活率(圖4；P<0.05)。相反，TGFβ2的表達則會導致患者的存活率下降(r=0.239，P=0.011；圖5)。而TGFβ3表達水平則和患者的存活率以及無病存活時間之間沒有關系。影響患者生存的獨立預后因素主要有腫瘤分期和等級，樣本中淋巴結數量，切除范圍(R0，R1，R2)，只有TGFβ1可以作為獨立預后因素(表2)。

TGFβ1(×400) TGFβ2(×200) TGFβ3(×400)

圖2 TGFβ2和TGFβ3表達的關系

圖3 TGFβ1表達與無病存活率間的關系

圖4 TGFβ1表達與總存活率間的關系

圖5 TGFβ2表達與存活時間的相關性

3 討 論

TGFp是一類多肽類生長因子，對細胞的增殖與分化、細胞外基質的產生、血管的生成、細胞凋亡及機體免疫系統均起著重要的調節作用。在哺乳動物TGF-p有3種:TGFβ1、β2、β3，分別由不同的基因編碼〔5〕，具有組織特異性，TGFp信號傳導發生障礙，引起包括自身免疫疾病、腫瘤等許多疾病。最近的一些試驗主要觀察了胃癌中TGFβ1的表達，結果都提示胃癌中TGFβ1 mRNA的表達可能與早期胃癌的預后有關，在病理標本中淋巴結為陰性〔6〕，無腫瘤周圍神經束及外膜侵犯的早期胃癌患者腫瘤細胞中的TGFβ1 mRNA的表達提高。這些結果與本試驗結果一致，說明低惡度腫瘤中TGFβ1表達水平更高,預后更好。另外，Zhou等〔7〕發現TGFβ1(+)腫瘤患者5年存活率為55.9%，而TGFβ1(-)腫瘤患者5年存活率為67%，說明TGFβ1表達會改善預后。Ma等〔8〕指出TGFβ1表達與預后有關，并且可以作為獨立預后指標，同時組織活檢樣本中TGFβ1 mRNA的水平與患者治療結果有關，并且可能作為一種新的預后工具。Ma等〔8〕的結果與本試驗結果一致，都說明TGFβ1表達水平可以作為一種獨立預后因素。TGFβ1在參與腫瘤的發生、發展、轉移，這與其在其他惡性腫瘤中的表達模式相似，尤其是與結直腸癌中TGFβ1的表達模式尤為一致。由于TGFβ1特異在癌細胞中活躍合成，因此其參與胃癌的形成〔9〕。低惡度腫瘤中TGFβ1的表達水平高于高惡度的腫瘤。其機制可能與腫瘤TGF-1表達減少時，細胞生長不能停留在G1期，細胞分裂增殖失去控制〔10〕，類上皮樣生長因子表達上調，黏膜上皮惡性程度增加有關。因此推測在高惡度胃癌(分化不良的腸道腫瘤或有明顯擴散腫瘤)中，還可以有其他機制參與。本研究說明TGFβ2是在腫瘤發展過程中產生的,而非其始動因素。TGFβ3的表達與腫瘤分期和等級之間無關。推測TGFβ3可能不參與腫瘤形成。

先前試驗提示TGFβ1基因敲除小鼠會出現多位點炎癥疾病〔10〕，這就表明TGFβ1在抑制過度炎癥反應中起重要作用。另一方面，TGFβ3/小鼠出現輕度表皮細胞分化缺陷，表現為腭片融合形成唇腭裂。其中TGFβ2缺失的表型最為嚴重，會導致多種發育缺陷。這些現象提示這3種分子(TGFβ1、β2和β3)在正常發育過程中起到了不同的作用〔11〕，并且這些分子在腫瘤發生過程中也有不同的作用。這也解釋了3種分子在腫瘤和正常胃黏膜上皮細胞中表達模式的差異及TGFβ1和β2與患者存活率之間的關系的差異。TGFβ1表達作為獨立預后指標，并且在TGFβ1表達缺陷會導致腫瘤惡性程度提高，這就提示低惡性度胃癌的靶向增加TGFβ1的表達可能是一種有效的輔助治療手段或者是化療保護策略〔12〕。

總之，胃癌組織中TGFβ 3種異構體存在表達差異，這種差異反映在惡性腫瘤表型和患者存活率上。仍需進一步研究確定這些分子的表達與胃癌進程之間的關系。

4 參考文獻

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