MCT1 CD147在人膠質(zhì)瘤中的表達與預(yù)后的相關(guān)性

韓 松 董 韜 于春泳 曹 鵬 潘冬生 魏學(xué)忠 馮思哲

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科 沈陽 110016

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·論著·

MCT1 CD147在人膠質(zhì)瘤中的表達與預(yù)后的相關(guān)性

韓 松 董 韜 于春泳 曹 鵬 潘冬生 魏學(xué)忠 馮思哲△

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科 沈陽 110016

目的 探討MCT1、CD147在人膠質(zhì)瘤中的表達及其與預(yù)后的相關(guān)性，分析其作為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷指標及藥物治療靶點的可能性。方法 本文采用實時熒光定量PCR和western blotting方法檢測MCT1和CD147在不同級別膠質(zhì)瘤及正常組織中的表達情況，并利用生存曲線對患者的生存預(yù)后進行分析。 結(jié)果 MCT1和CD47在人膠質(zhì)瘤患者組織中均高表達，且高級別膠質(zhì)瘤患者MCT1和CD147表達與低級別膠質(zhì)瘤患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低級別膠質(zhì)瘤患者MCT1和CD147與正常組織表達差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同級別膠質(zhì)瘤患者與正常對照組MCT1和CD147表達生存相關(guān)曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MCT1和CD47是神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的重要標志物，且二者可以作為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷的指標參考及藥物治療的靶點。

MCT1；CD147；膠質(zhì)瘤；預(yù)后；相關(guān)性

膠質(zhì)瘤又稱神經(jīng)膠質(zhì)瘤，多發(fā)生于神經(jīng)外胚層，具有生長迅速、侵襲能力強以及容易復(fù)發(fā)等特點[1-2]。膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤最常見的一種，可根據(jù)其生物學(xué)特征采用磁共振、超聲波、放射學(xué)核素進行定位，準確率幾乎達到100%，但是目前對膠質(zhì)瘤，尤其是高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療效果不甚理想。MCT1是一種跨膜蛋白，存在于多種腫瘤組織中，對乳酸具有較高的親和力，主要在乳酸的細胞跨膜運輸中起作用[3-4]。CD147蛋白可以輔助MCT1在細胞膜上正確定位，參與其形成正確的結(jié)構(gòu)，且在多種腫瘤發(fā)生及侵襲中發(fā)揮作用[5-6]。本文旨在探討MCT1、CD147在人膠質(zhì)瘤中的表達及其與預(yù)后的相關(guān)性，為臨床相關(guān)腫瘤的診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本文選取我院2008-03—2011-03經(jīng)過病理切片及免疫組織化學(xué)證實的50例膠質(zhì)瘤患者標本進行研究。其中低級別膠質(zhì)瘤14例(包括少突膠質(zhì)細胞瘤5例，Ⅰ/Ⅱ級星形細胞瘤9例)，高級別膠質(zhì)瘤36例(包括間變性星形細胞瘤8例，Ⅲ/Ⅳ級星形細胞瘤16例，多形性細胞膠質(zhì)瘤12例)。

1.2 試劑與儀器 CD147鼠抗人單克隆抗體、MCT1 鼠抗人單克隆抗體購自SANTA公司。S-P免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒購自北京中山生物有限公司。CK40相差顯微鏡為OLYMPUS產(chǎn)品。高純總RNA 提取試劑盒、TRIzol、氯仿均購自BioTek公司，qRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 第一鏈合成系統(tǒng)購自Invitrogen 公司，引物管家基因β-actin、目的基因(MCT1、CD147)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa 公司。基因引物序列見表1。

表1 CD147及MCT1引物序列及擴增長度

1.3 實時熒光定量PCR qRT-PCR(羅氏LightCycler480實時熒光PCR系統(tǒng))的擴增體系：2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。反應(yīng)條件：95℃10 s，60℃ 40 s，共28個循環(huán)。通過2%瓊脂糖凝膠電泳及熔解曲線鑒定qRT-PCR產(chǎn)物，并用公式(ΔCt) 進行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.4 Western Blotting分析 腫瘤組織和正常組織充分勻漿，考馬斯亮藍法蛋白定量后以等量蛋白進行SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上后5%脫脂牛奶封閉2 h。然后與一抗溫孵過夜，PBS漂洗3次后與HRP標記二抗(1：200)室溫反應(yīng)1 h，顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以β-actin作為參照，進行蛋白表達的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 q-PCR分析MCT1和CD147在不同級別膠質(zhì)瘤組織中表達的差異 q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，MCT1和CD147在不同級別膠質(zhì)瘤組織中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在高級別膠質(zhì)瘤中表達最強，而正常組織中表達最弱，見表2。

表2 q-PCR分析MCT1和CD147在不同級別 膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達的差異(△Ct)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組相比，$P<0.05

2.2 Western Blotting分析MCT1和CD147在不同級別膠質(zhì)瘤組織中表達的差異 Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)，MCT1和CD147蛋白在不同級別膠質(zhì)瘤組織中表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且在高級別膠質(zhì)瘤中表達最強，而正常組織中表達最弱，見圖1、圖2。

圖1 Western Blotting檢測不同組織中MCT1蛋白的表達

圖2 Western Blotting檢測不同組織中CD147蛋白的表達

2.3 MCT1和CD47與膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存與預(yù)后的相關(guān)性 50例患者均在術(shù)后進行隨訪，并依據(jù)隨訪數(shù)據(jù)分別繪制MCT1陽性組(高表達組患者+低表達組患者)、對照組患者和CD147陽性組(高表達組患者+低表達組患者)及對照組患者的Kaplan-Meier生存曲線。通過比較發(fā)現(xiàn)，MCT1和CD147蛋白陽性表達組患者曲線基本全程位于對照組曲線下部(圖3)。MCT1陽性表達組與對照組生存率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，CD147陽性組和對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 MCT1(A)和CD147(B)高陽性、低陽性及對照組生存曲線

3 討論

世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生率和病死率有逐年升高趨勢，給人類生活質(zhì)量和醫(yī)療事業(yè)帶來巨大的不利影響。研究表明，各種惡性腫瘤組織在氧氣充足的情況下主要依靠糖酵解供應(yīng)能量，而糖酵解過程卻產(chǎn)生大量乳酸。如果乳酸的轉(zhuǎn)運速率與產(chǎn)生的速率不能同步，則會引起細胞內(nèi)pH值明顯降低，最終會導(dǎo)致腫瘤細胞的功能喪失，導(dǎo)致細胞的凋亡、死亡。

MCTs家族在直腸癌、乳腺癌以及卵巢癌等實體腫瘤中均有表達，且MCT1表達較高。MCT1是一種跨膜蛋白，主要在乳酸的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮作用，腫瘤細胞通過MCT蛋白將細胞內(nèi)的乳酸轉(zhuǎn)移到癌旁組織來維持腫瘤細胞內(nèi)正常的pH值，維護細胞的正常生理功能和活性[7-8]。如果多余的乳酸未及時轉(zhuǎn)運出細胞，細胞酸化將明顯抑制糖酵解的反應(yīng)方向與速度，加劇細胞的酸化并最終引起細胞死亡。Sonveaux研究表明，腫瘤細胞的滅活可以通過抑制MCT1蛋白的表達來實現(xiàn)，具有明顯的臨床意義[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中MCT1的mRNA和蛋白質(zhì)表達比低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中MCT1的表達更高，同時高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤生存曲線均位于低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存曲線。因此，MCT1可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷的指標參考及藥物治療的靶點。

MCT1進入細胞膜上的正確位點，形成跨膜通道并建立乳酸轉(zhuǎn)運的生理功能必須依賴于細胞膜上的CD147蛋白的引導(dǎo)[10-11]。CD147是細胞表面的黏附分子，具有誘導(dǎo)腫瘤組織侵襲、協(xié)助MCT蛋白表達等多種生理功能。CD147蛋白是MCT蛋白進行乳酸轉(zhuǎn)運和維系腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境酸堿平衡的重要分子。有研究表明，CD147在惡性腫瘤組織細胞膜上有較強的表達[12-13]，但在正常組織中表達幾乎為零。本研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，CD147具有較高的表達，同時正常組織中也有微弱的表達。同時我們也發(fā)現(xiàn)，高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤生存曲線均位于低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存曲線。因此，CD147也可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷的指標參考及藥物治療的靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，MCT1、CD 47 mRNA和蛋白質(zhì)在人膠質(zhì)瘤患者組織中均高表達，且高級別膠質(zhì)瘤患者MCT1和CD147表達與低級別膠質(zhì)瘤患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低級別膠質(zhì)瘤患者MCT1和CD147與正常患者表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。MCT1和CD147表達生存相關(guān)曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，MCT1和CD47是膠質(zhì)瘤惡性程度的重要標志物，且二者可以作為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷的指標參考及藥物治療的靶點。

[1] Warren KE. Diffuse intrinsic pontine glioma: poised for progress[J]. Front Oncol, 2012, 2:205-211.

[2] Gao X, McDonald JT, Hlatky L,et al. Acute and fractionated irradiation differentially modulate glioma stem cell division kinetics [J]. Cancer Res, 2012,73(5):1 481-1 490.

[3] Miranda-Goncalves V, Honavar M, Pinheiro C,et al. Monocarboxylate transporters (MCTs) in gliomas: expression and exploitation as therapeutic targets [J]. Neuro-oncology, 2012,15(2):172-188.

[4] Mac M, Nalecz KA. Expression of monocarboxylic acid transporters (MCT) in brain cells. Implication for branched chain alpha-ketoacids transport in neurons[J]. Neurochem Int, 2003,43(4-5):305-309.

[5] Gu J, Zhang C, Chen R,et al. Clinical implications and prognostic value of EMMPRIN/CD147 and MMP2 expression in pediatric gliomas[J]. Euro J Pediat, 2009,168(6):705-710.

[6] Li H, Chen J, He M,et al.Expression of CD147 and MMP-2 in human gliomas and its correlations with prognosis[J]. Sichuan da xue xue bao Yi xue ban = J Sichuan University, 2007,38(3):396-399.

[7] Saksena S, Theegala S, Bansal N,et al. Mechanisms underlying modulation of monocarboxylate transporter 1 (MCT1) by somatostatin in human intestinal epithelial cells [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009,297(5):G878-885.

[8] Takebe K, Nio-Kobayashi J, Takahashi-Iwanaga H,et al. Cellular expression of a monocarboxylate transporter (MCT1) in the mammary gland and sebaceous gland of mice [J]. Histochem Cell Bioloy, 2009,131(3):401-409.

[9] Sonveaux P, Vegran F, Schroeder T,et al. Targeting lactate-fueled respiration selectively kills hypoxic tumor cells in mice[J]. J Clin Invest, 2008,118(12):3 930-3 942.

[10] Le Floch R, Chiche J, Marchiq I,et al. CD147 subunit of lactate/H+ symporters MCT1 and hypoxia-inducible MCT4 is critical for energetics and growth of glycolytic tumors[J]. PNAS, 2013,108(40):16 663-16 668.

[11] de Oliveira AT, Pinheiro C, Longatto-Filho A,et al. Co-expression of monocarboxylate transporter 1 (MCT1) and its chaperone (CD147) is associated with low survival in patients with gastrointestinal stromal tumors (GISTs) [J]. J Bioenergetics Biomembranes, 2012,44(1):171-178.

[12] Zhong WD, Han ZD, He HC,et al. CD147, MMP-1, MMP-2 and MMP-9 protein expression as significant prognostic factors in human prostate cancer[J]. Oncology, 2008,75(3-4):230-236.

[13] Voigt H, Vetter-Kauczok CS, Schrama D,et al.CD147 impacts angiogenesis and metastasis formation[J]. Cancer Invest, 2009,27(3):329-333.

(收稿2013-10-10)

Expressions of MCT1 and CD147 in human gliomas and their correlations with prognosis

HanSong,DongTao,YuChunyong,CaoPeng,PanDongsheng,WeiXuezhong,FengSizhe

DepartmentofNeurosurgery,theGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110016,China

Objective To investigate the expression and prognostic significance of MCT1, CD147 in human gliomas and analyze the possibility of glioma prognosis as drug targets. Methods The expression of CD147 and MCT1 were detected by real-time PCR and Western blotting in different grade of glioma and normal tissues. And the prognosis of patients with survival curve was also analyzed. Results The expression of MCT1 and CD47 in human glioma patients showed high density. And the expression of MCT1 and CD147 in high grade glioma was significantly different with that in low level grade glioma (P<0.05). the expression of MCT1 and CD147 in different grades of glioma patients and normal control group had significant difference in survival curve. Conclusion MCT1 and CD47 are important signs of malignancy of neuro-glioma, and the two dictators can be used as a target for drug treatment and judging the prognosis of it.

MCT1; CD147; Glioma; Prognosis;Correlation

R730.264

A

1673-5110(2014)01-0001-03

△通訊作者：馮思哲，副主任醫(yī)師，E-mail：qkzztg123@163.com