乳腺癌中FoxP3表達與上皮間質轉化的相關性及其意義*

霍莉莉 李 慧 魏 楓 趙 華 任秀寶

乳腺癌中FoxP3表達與上皮間質轉化的相關性及其意義*

霍莉莉 李 慧 魏 楓 趙 華 任秀寶

目的：探討乳腺癌組織FoxP3、TGF-β1的表達和上皮間質轉化（EMT）的相互關系及其臨床意義。方法：免疫組織化學法檢測74例乳腺癌組織中FoxP3、TGF-β1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表達情況，分析乳腺癌FoxP3蛋白表達與臨床病理特征的關系，以及FoxP3、TGF-β1的表達和EMT發生之間的關系。結果：FoxP3與TGF-β1的表達率和EMT的發生率分別為36.5%（27/74）、39.2%（29/74）和40.5%（30/74）。乳腺癌FoxP3表達與淋巴結轉移相關（P＜0.05），與其他臨床病理特征無關（P＞0.05）。FoxP3和TGF-β1的表達之間存在相關性，而TGF-β1可以促進EMT發生（P＜0.05）。結論：FoxP3的表達與乳腺癌淋巴結轉移和EMT的發生相關，可能作為預測乳腺癌轉移可能性的標記物。

乳腺癌 FoxP3 TGF-β1 上皮間質轉化

FoxP3是叉頭樣轉錄因子家族的成員之一，早期發現其特異性表達于CD4+CD25+調節性T細胞，參與細胞發育和免疫抑制功能的發揮［1］。近年來發現，乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細胞也有FoxP3的表達［2-4］。有研究認為腫瘤細胞表達FoxP3能夠促進腫瘤發生淋巴結轉移和遠處轉移，是腫瘤預后不良的獨立預測因素之一［5-8］。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是具有極性的上皮細胞轉化成為具有移行能力的間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，其在人胚胎干細胞分化過程中起著關鍵作用，在組織修復再生、器官纖維化和腫瘤發生時被重新激活［9］。目前普遍認為EMT是腫瘤細胞發生侵襲與轉移的重要機制［10-12］。

本研究采用免疫組織化學方法檢測FoxP3蛋白和EMT標志物在人乳腺癌組織中的表達水平，探討FoxP3和EMT之間是否存在相互聯系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者資料 所有標本均取自天津醫科大學腫瘤醫院乳腺外科2003年5月至2005年7月手術切除的浸潤性乳腺癌組織標本，共74例，經病理確診均為非特殊型浸潤性導管癌?；颊呔鶠榕裕挲g分布27～69歲（中位年齡49歲）。手術前均未接受過抗癌治療（包括放療、化療及內分泌治療等）。術后分期：Ⅰ期3例，ⅡA期26例，ⅡB期24例，ⅢA期8例，ⅢB期2例，ⅢC期10例，Ⅳ期1例。組織學分級：Ⅰ級4例，Ⅱ級49例，Ⅲ級21例。ER（+）14例，PR（+）12例，Her-2（+）45例。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人FoxP3單克隆抗體（PCH101）購自美國eBioscience公司。兔抗人TGF-β1多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Fibronectin鼠抗人單克隆抗體購自美國BD公司。EnVision兩步法免疫組織化學檢測試劑購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測乳腺癌組織中FoxP3、TGF-β1和EMT標志物的表達 標本經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色及En-Vision法免疫組織化學染色。石蠟切片常規脫蠟水化，檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復，3%H2O2室溫孵育20 min阻斷內源性過氧化物酶活性。滴加一抗，4℃孵育過夜。滴加酶標記的二抗，濕盒室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精對比染色。常規酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.2 陽性結果判斷 1）FoxP3以乳腺癌細胞細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達，陽性細胞數≥25%為FoxP3表達陽性切片。2）TGF-β1以細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。結果采用半定量計分方法，陽性細胞數按無著色、陽性細胞數≤20%、21%～50%和＞50%分別判為0、1、2、3分，著色強度按無著色、黃色、棕黃色和棕褐色分別判為0、1、2、3分。兩項評分結果相乘＞6視為強陽性表達。3）EMT標志物：①E-Cadherin以細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞50%為陽性切片。②N-Cadherin以細胞膜和（或）細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片。③Vimentin以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片。④Fibronectin以細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達，陽性細胞數＞1%為陽性切片。其中E-Cadherin為上皮細胞標志物，N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin為間質細胞標志物。上皮細胞標志物表達陰性或者任一間質細胞標志物表達陽性計為EMT陽性（+）。

1.3 統計學方法

數據采用PASW Statistics 18.0統計軟件進行Mann-Whitney U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗和χ2檢驗，用偏相關分析和二元Logistic回歸分析進行相關性分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 FoxP3和TGF-β1的表達情況

FoxP3在乳腺癌細胞最常見的表達部位為細胞質，其次為細胞質與細胞核均表達，最少見的表達模式是僅細胞核表達?？紤]到FoxP3是轉錄因子，只有進入細胞核內才能發揮作用，所以將胞核陽性作為FoxP3表達陽性的評價標準。在所有檢測的乳腺癌組織中，36.5%（27/74）的病例FoxP3蛋白表達陽性。39.2%（29/74）的病例高表達TGF-β1（圖1）。

2.2 乳腺癌組織FoxP3的表達與患者臨床病理特征的關系

比較乳腺癌實質FoxP3蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、pTNM分期、ER、PR、Her-2的關系，發現FoxP3的表達與淋巴結轉移有關（P＜0.05），與其他指標無關（P＞0.05，表1）。

2.3 EMT標志物的表達情況

E-Cadherin主要表達于細胞膜，部分亦表達于細胞質。其陽性表達率為71.6%。N-Cadherin表達于細胞膜和（或）細胞質，其陽性表達率為37.8%。Vimentin表達于細胞質，其陽性表達率為20.3%。Fibronectin表達于細胞膜，其陽性表達率為12.2%。根據EMT發生的判定標準，EMT陽性率為40.5%（圖1）。

2.4 乳腺癌中FoxP3、TGF-β1和EMT發生的相關情況

1）應用二元Logistic回歸分析向后步進法分析FoxP3和TGF-β1與EMT的關系。以EMT為因變量Y（未發生=0，發生=1），以FoxP3和TGF-β1為自變量X，建立 Logistic回歸模型：Logit（p）=-0.901+1.249×TGF-β1。Logistic回歸模型似然比檢驗結果差異有統計學意義（χ2=6.481，df=1，P=0.011），回歸系數Wald χ2檢驗顯示P=0.013。優勢比OR=3.487（1.308，9.297），95%CI上下限均＞1，因此可以認為TGF-β1的表達可以誘導EMT發生。2）在控制EMT的條件下進行FoxP3與TGF-β1的偏相關分析，發現兩者之間存在相關性（P＜0.001）?？蓳苏J為在消除EMT影響的條件下，乳腺癌FoxP3與TGF-β1的表達間存在相關性。

圖1 免疫組織化學檢測FoxP3、TGF-β1和EMT標志物的表達 （SP×400）Figure 1 Immunohistochemical staining detected the expression of FoxP3,TGF-β1 and markers of EMT （SP×400）

表1 乳腺癌組織FoxP3的表達與患者臨床病理特征的關系Table 1 Correlation between expression of FoxP3 and clinicopathologic features of breast carcinoma

3 討論

FoxP3是影響CD4+CD25+調節性T細胞發育的一個關鍵轉錄因子，并且能維持其免疫抑制功能，一直被認為是CD4+CD25+調節性T細胞的特異性標志［13］。之后研究發現FoxP3在部分CD4+CD25-T細胞和CD8+T細胞也有表達［14］，而近年來研究證實FoxP3在多種人正常上皮細胞和腫瘤細胞亦有表達，影響腫瘤的發生發展以及腫瘤細胞與腫瘤微環境之間的相互作用。胰腺癌和黑色素瘤細胞異常表達FoxP3，在共培養條件下能夠抑制初始CD4+CD25-T細胞的增殖，促進腫瘤細胞免疫逃逸［2，15］。

本研究結果顯示，在74例檢測的乳腺癌組織中，36.5%的病例FoxP3蛋白表達陽性，并且乳腺癌組織表達FoxP3與淋巴結轉移相關（P＜0.05），提示FoxP3可能在腫瘤的進展和轉移過程中發揮作用。Merlo等［8］發現乳腺癌表達FoxP3能夠作為發生遠處轉移風險的預測因素。同時，本研究也發現FoxP3的表達與轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達以及EMT相關，提示其可能通過調節TGF-β1而影響EMT，從而影響腫瘤的進展。

上皮細胞在EMT過程中發生一系列生物學改變，如細胞極性消失、喪失細胞間連接、細胞游走或散在分布以及重新表達間質細胞標志物等，從而轉化為具有間質特點的間質樣細胞［9］。EMT不僅存在于胚胎發育和組織分化過程中，同時也參與組織修復、器官纖維化以及腫瘤的浸潤轉移［9］。EMT能夠賦予細胞侵襲和轉移能力、誘導干細胞特性、阻止自身凋亡和衰老以及誘發免疫抑制等［9］，這些特性對于腫瘤的侵襲與轉移至關重要，因此近年來EMT的誘發因素及其與腫瘤微環境之間的相互作用一直是研究熱點。轉化生長因子-β、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、基質金屬蛋白酶等都可以誘導腫瘤細胞發生EMT，而其中研究時間最久、機制闡釋最為透徹的就是TGF-β1［16-19］。在體外培養條件下外源添加TGF-β1能夠誘導乳腺癌細胞系發生EMT［20］，而近年來研究認為細胞自分泌TGF-β1在誘導細胞發生EMT中發揮作用，同時也參與細胞經歷EMT后的間質細胞樣狀態的維持［21-22］。Zuo等［3］報道乳腺癌細胞表達FoxP3。有文獻報道用siRNA抑制黑色素瘤細胞表達FoxP3能夠下調TGF-β1的表達；反之，過表達FoxP3能夠上調TGF-β1的表達［15］。即腫瘤細胞可以通過FoxP3上調TGF-β1的表達，從而影響EMT作用進而促進腫瘤的進展和轉移。

本實驗發現乳腺癌細胞FoxP3的表達和TGF-β1的高表達之間存在相關性，而且TGF-β1與EMT發生相關（P＜0.05）。推測乳腺癌細胞可能通過FoxP3調節TGF-β1表達，而TGF-β1通過自分泌的形式參與乳腺癌細胞EMT的發生與維持過程。近期研究表明，FoxP3可以控制多種與TGF-β信號通路和EMT相關的基因表達，進一步支持了本文的結論［23］。

雖然隨著治療方法的不斷改進，乳腺癌的生存率得到了極大地提高，但是腫瘤轉移仍然是威脅患者生存的重要原因。本結果顯示FoxP3在乳腺癌轉移中扮演重要角色，有可能是新的分子標志物，成為免疫治療的新靶點。

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（2013-07-13收稿）

（2013-08-24修回）

Clinical significance of FoxP3 and the correlation of FoxP3 expression with epithelial-mesenchymal transition in breast cancer

Lili HUO1,2,3,Hui LI1,2,3,Feng WEI1,2,3,Hua ZHAO1,2,3,Xiubao REN1,2,3

Xiubao REN;E-mail:rwziyi@yahoo.com
1Department of Immunology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,2National Clinical Research Center of Cancer,and3Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin 300060,China.

Objective:This study aims to investigate the correlation between the expression of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer and to determine the clinical significance of FoxP3.Methods:The expression of FoxP3,TGF-β1,E-Cadherin,N-Cadherin,Vimentin,and Fibronectin protein were detected in the cancer cells of 74 cases with breast carcinoma via immunohistochemistry.The correlation of FoxP3 protein with clinico-pathologic features of breast carcinoma and the relationships among the expressions of FoxP3,TGF-β1,and epithelial-mesenchymal transition(EMT)were analyzed.Results:The expression rates of FoxP3,TGF-β1,and EMT are 36.5%(27/74),39.2%(29/74),and 40.5%(30/74),respectively.The FoxP3 protein expression in breast cancer is correlated with lymph node metastasis(P＜0.05)but not with other clinico-pathological features(P＞0.05).The expression of FoxP3 is also correlated with the expression of TGF-β1.Furthermore,TGF-β1 can induce EMT(P＜0.05).Conclusion:The expression of FoxP3 is correlated with lymph node metastasis and EMT in breast cancer.Therefore,FoxP3 may be a marker for predicting metastasis.

breast cancer,FoxP3,TGF-β1,epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-8179.20131533

天津醫科大學腫瘤醫院免疫室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81171983）、天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（編號：12JCYBJC16100）和國家重點基礎研究發展計劃“973”項目（編號：2012CB9333004）資助

任秀寶 rwziyi@yahoo.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171983),Tianjin Research Projects for Application Foundation and cutting-edge Technologies(No.12JCYBJC16100)and the National"973"Program of China(No.2012CB9333004).

（本文編輯：賈樹明）

霍莉莉 碩士生在讀，主要研究方向為腫瘤免疫在腫瘤轉移中的作用機制。

E-mail：shanping.li@aliyun.com