非小細胞肺癌組織中P-ACC及COX-2的相關性研究

李韶今 張相民 李 榮 劉聯斌 葉永強 王冬梅 羅忠兵

非小細胞肺癌組織中P-ACC及COX-2的相關性研究

李韶今①張相民①李 榮②劉聯斌①葉永強③王冬梅②羅忠兵③

目的：探討非小細胞肺癌組織中乙酰輔酶A羧化酶磷酸化后的產物（P-ACC）與環氧合酶-2（COX-2）的表達及其與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期及病理類型的關系，并研究兩者的相關性。方法：以62例非小細胞肺癌患者的肺癌組織作為研究組，20例因其他它原因行肺葉切除患者的正常肺組織作為對照組。應用免疫組織化學SP法檢測肺癌組織及正常肺組織中P-ACC、COX-2的表達情況。結果：P-ACC、COX-2在非小細胞肺癌和正常肺組織中的陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05）。在非小細胞肺癌中，P-ACC的陽性表達與腫瘤大小顯著相關（P＜0.05），而與淋巴結轉移、臨床分期及病理類型無關；COX-2的陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期及病理類型無關。P-ACC與COX-2的陽性表達之間呈顯著負相關（r=-2.37，P=0.032）。結論：P-ACC在非小細胞肺癌組織中的陽性表達降低；COX-2在非小細胞肺癌組織中陽性高表達，二者呈顯著負相關，提示P-ACC陽性表達降低可能激活COX-2陽性表達，可促進非小細胞肺癌的發生、發展及侵襲轉移。

非小細胞肺癌 P-ACC 環氧合酶-2 免疫組織化學

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的腫瘤，發病率男性和女性分別升至第一位和第二位［1-2］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%，NSCLC早期診斷困難［3］。多年來，NSCLC以手術為主的綜合治療并沒有獲得滿意的生存率，治療后的5年生存率一直維持在40%左右，約2/3的NSCLC患者在確診時已不可切除以及術后輔助化療耐藥是NSCLC總體治療效果不佳的重要原因［4-5］。

近年不少研究顯示，NSCLC的發病機制與體內失控的炎癥反應相關［6］，而作為炎癥反應重要節點的COX-2與NSCLC 的關系十分密切［7］，但其與P-ACC相關性的研究鮮見報道。本實驗通過免疫組織化學SP法檢測、探討P-ACC和COX-2在NSCLC組織及正常肺組織中的表達、兩者的相關性及在NSCLC發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例資料 隨機選取贛州市腫瘤醫院（贛州市腫瘤防治研究所）2008年1月至2010年12月有完整臨床病理資料，病理檢查證實為NSCLC的62例患者作為研究組，20例因其他原因行肺葉切除患者作為對照組。NSCLC組，男48例，女14例；年齡21～69歲，平均55.65歲；其中鱗癌33例，腺癌16例，腺鱗癌8例，大細胞癌2例，類癌1例，淋巴上皮樣癌1例，原位癌1例。本文符合本院倫理委員會標準。

1.1.2 主要試劑及來源 P-ACC試劑購置美國Cell Signaling Technology公司，COX-2試劑購置美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 標本經中性甲醛固定，石蠟包埋，常規切片，厚度約4 μm。采用免疫組織化學SP二步法。切片常規脫蠟后置蒸餾水玻璃缸，根據所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理（檸檬酸pH6.0）；3%過氧化氫去離子水孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶；PBS沖洗、2 min×4次；滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗，2 min×4次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育15 min，PBS沖洗、2 min×4次；應用DAB溶液顯色，顯微鏡下控制，去離子水沖洗多余未結合的顯色液；水洗、蘇木素復染2 mins、1%鹽酸酒精分化2～5 s；返藍5 min、脫水、透明封片。顯微鏡下觀察結果。

1.2.2 結果判定 在400倍視野下，每例隨機選取不重復5個視野，然后按陽性細胞占全部細胞的百分率分為：表達陰性（-），即無陽性細胞或僅有個別細胞；表達弱陽性（+），即10%＜陽性細胞數≤25%；表達中度陽性（++），即25%＜陽性細胞數≤50%；表達強陽性（+++），即陽性細胞數＞50%。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件完成，P-ACC和COX-2蛋白的表達情況采用等級資料的秩和檢驗和χ2檢驗，P-ACC和COX-2蛋白表達的相關性采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 P-ACC和COX-2蛋白在NSCLC組織及正常肺組織中的表達

在正常肺組織中，P-ACC蛋白染色多為陽性（16/20，80%），而在62例NSCLC組織中僅21例呈陽性染色（33.9%），統計學差異顯著（P=0.000 1）；COX-2蛋白染色在正常肺組織中表達較低（4/20，20%），而在62例NSCLC組織中有41例呈陽性染色（41/62，66.1%），統計學差異顯著（P=0.004 0，表 1）。在NSCLC組織中，P-ACC和COX-2蛋白的陽性染色均呈淡黃色至棕褐色顆粒狀，分布于癌細胞的細胞漿部位，細胞膜和細胞核未見明顯染色（圖1，2）；P-ACC蛋白在正常肺組織中的陽性染色（圖3），COX-2蛋白在正常肺組織中的陽性染色（圖4）。

2.2 NSCLC組織中P-ACC和COX-2蛋白表達與臨床病理參數的關系

NSCLC組織中P-ACC蛋白的陽性表達率與性別、年齡、臨床分期、淋巴結轉移及病理類型均無相關性，但是P-ACC蛋白的陽性表達率與腫瘤大小密切相關，T2（3 cm＜T≤7 cm）的25.0%表達明顯低于T3（T＞7 cm）的50.0%，T3的表達明顯低于T1（T＜3 cm）的75.0%，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。COX-2的陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期及病理類型無關（表2）。

2.3 NSCLC組織中P-ACC和COX-2蛋白表達的關系

62例NSCLC組織中P-ACC與COX-2均表達陰性10例（16.1%）；P-ACC表達陰性，COX-2表達陽性31例（50.0%）；P-ACC表達陽性，COX-2表達陰性11例（17.7%）；P-ACC與COX-2均表達陽性10例（16.1%）。P-ACC陰性組的COX-2蛋白表達陽性率為75.6%，P-ACC陽性組的COX-2蛋白表達陽性率為 47.6%，兩者差異有統計學意義（P＜0.05，表3。Spearman等級相關分析表明P-ACC表達與COX-2表達呈顯著負相關（r=-2.37，P=0.032）。

表1 P-ACC和 COX-2蛋白表達情況Table 1 The expression of P-ACC and COX-2 proteins

?圖1 P-ACC在NSCLC中表達陽性 （H&E×100）Figure 1 Positive expression of P-ACC in NSCLC （H&E×100）

圖2 COX-2在NSCLC中表達陽性 （H&E×100）Figure 2 Positive expression of COX-2 in NSCLC （H&E×100）

圖3 P-ACC在正常肺組織中表達陽性 （H&E×100）Figure 3 Positive expression of P-ACC in normal lung tissue（H&E×100）

圖4 COX-2在正常肺組織中表達陽性 （H&E×100）Figure 4 Positive expression of COX-2 in normal lung tissue（H&E×100）

表2 NSCLC組織中P-ACC和COX-2表達與臨床病理參數的關系Table 2 The correlation of expression of COX-2 and P-ACC proteins with the clinicopathologic parameters of NSCLC

表3 NSCLC組織中P-ACC和 COX-2蛋白表達的相關性Table 3 The correlation between expression of P-ACC and COX-2 proteins in NSCLC

3 討論

P-ACC是腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）被激活后，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）磷酸化失活而形成的，P-ACC是AMPK的下游直接靶蛋白，可以直接反映AMPK的激活狀態［8］。AMPK激活后可顯著減輕機體炎癥介質的表達，減少組織的炎癥損傷，比如轉染失活突變的AMPK或其siRNA可明顯增強脂多糖誘導的巨噬細胞的TNF-α及IL-6表達，但是轉染激活型的AMPK則可以顯著抑制脂多糖誘導的TNF-α及IL-6表達［9］。動物實驗也證實，在脂多糖暴露小鼠血清中細胞因子水平及腦組織中炎癥相關基因表達水平上，使用AMPK激活劑可以使其表達顯著降低［10］，并明顯減弱缺血再灌注小腸中白細胞與血管內皮細胞的黏附［11］；AMPK激活劑可明顯減輕三硝基苯磺酸誘導的腸炎模型中結腸組織的炎癥細胞浸潤，減少破壞杯狀細胞和隱窩細胞，這些保護效應可以使TNF-α、INF-γ和IL-17在結腸組織中的含量顯著降低［12］。另一研究也證實AMPK激活劑可以有效減輕脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中中性粒細胞的聚集，并可以減少、減輕肺間質水腫，降低TNF-α和IL-6在肺泡灌洗液中的濃度［13］。以上研究說明，AMPK的活性可以調節炎癥反應，AMPK的失活促進炎癥的發展。AMPK在腫瘤患者體內活性降低，如肝細胞癌中AMPK表達下調，AMPK失活促進肝癌的發展［14］。本研究發現，P-ACC在62例NSCLC組織中僅21例呈陽性染色（33.9%），較正常肺組織表達相比明顯降低，證明在NSCLC中AMPK的活性下降，AMPK的失活促進炎癥的發展，失控的炎癥反應可能導致NSCLC的發生，在NSCLC的發展初期（T＜3 cm），P-ACC的陽性表達率為75.0%，到中期（3 cm＜T＜7 cm）的陽性表達率最低為25.0%，說明隨著AMPK的活性下降，NSCLC進一步發展；但是隨著腫瘤的進一步發展，AMPK的活性又有所提高，在中晚期時（T≥7 cm）P-ACC的陽性表達率為50.0%，這可能與AMPK在腫瘤中的雙重作用有關，在腫瘤起始階段，AMPK失活幫助腫瘤細胞生長以及腫瘤細胞的浸潤轉移，當腫瘤發展到一定程度時，AMPK又開始激活抑制腫瘤細胞的生長［15］。

作為炎癥反應重要節點的COX-2在多個環節參與腫瘤的組成：抑制凋亡、抑制免疫功能、誘導腫瘤血管生成及腫瘤侵襲等［16-17］。有學者研究［18］COX-2在約1/3的不典型增生和原位癌組織中過表達，證明在癌前病變向惡性轉化中COX-2發揮了重要作用；另外該報道還證實了COX-2的著色程度在伴有淋巴結轉移的肺癌組織中要強于不伴有淋巴結轉移的肺癌組織。另有學者用原位雜交法研究COX-2在160例Ⅰ期NSCLC患者的癌組織中的表達情況，結果顯示：在早期NSCLC患者中COX-2過表達預示預后較差，因此可以將COX-2過表達列為NSCLC患者獨立的不良預后因素［19］。這些研究證實在肺癌的發生、發展過程中，COX-2在凋亡受阻、免疫降低、新生血管形成、侵襲轉移等過程中發揮關鍵作用。本文研究也證實COX-2蛋白染色在正常肺組織中表達較低（4/20，20%），而在62例NSCLC組織中有41例呈陽性染色（41/62，66.1%），統計學差異顯著，并且在晚期的NSCLC中表達強烈。

AMPK通過磷酸化抑制炎癥相關基因的表達，在炎癥的發生發展過程中發揮重要調節作用；COX-2也是炎癥反應的重要節點；體內失控的炎癥反應可以導致上皮細胞向間葉細胞化生，進一步促進了肺癌的發生、發展；大量失控的炎癥反應使機體患肺癌的風險大大增加［20］。本研究中重點研究P-ACC與COX-2的關系，病例選擇上沒有特意選與這兩個參數更相關的腺癌病例，而是從NSCLC整體出發，按NSCLC中鱗癌、腺癌的發病率而大致配備，雖然近年報道腺癌發病率增加，但仍然沒有精確的數據，本研究鱗癌仍較多。因此得出P-ACC及COX-2幾乎與臨床病理參數無關，可能與病例選擇有關。但是本研究證實P-ACC陰性組的COX-2蛋白表達陽性率為75.6%，P-ACC陽性組的COX-2蛋白表達陽性率為47.6%，兩者差異有顯著性意義（P＜0.05）。Spearman等級相關分析表明P-ACC表達與COX-2表達呈顯著負相關。說明在NSCLC中AMPK的失活可能激活COX-2陽性表達，促進非小細胞肺癌的發生、發展及侵襲轉移。

聯合檢測AMPK的活性與COX-2的表達有助于評估NSCLC的惡性程度和侵襲能力，從而為NSCLC的臨床防治增添新的思路，為NSCLC的治療可能提供新的靶點。

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（2013-08-06收稿）

（2013-10-26修回）

Correlation of P-ACC and COX-2 expression in non-small cell lung cancer tissues

Shaojin LI1,Xiangmin ZHANG1,Rong LI1,Lianbin LIU1,Yongqiang YE3,Dongmei WANG2,Zhongbing LUO3

Shaojin LI;E-mail:lsj1362@126.com
1Ganzhou Institute of Cancer Research,2Department of Pathology,Ganzhou Cancer Hospital,3Department of Thoracic,Ganzhou Cancer Hospital,Ganzhou 341000,China.

Objective:A study was conducted to determine the expression of acetyl-coa carboxylase product of phosphorylation(P-ACC)and an enzyme called cyclooxygenase 2(COX-2)in non-small cell lung cancer(NSCLC)tissue,as well as the relationship and correlations between tumor size,lymph node metastasis,clinical stage,and pathological type.Methods:Sixty-two patients with NSCLC lung cancer tissues were included in the patient group,whereas 20 patients who underwent lobectomy for other reasons and had normal lung tissues were included in the control group.Immunohistochemical streptavidin peroxidase method was used to detect the expression of P-ACC and COX-2 in lung cancer and normal lung tissues.Results:The positive expressions of P-ACC and COX-2 in NSCLC lung cancer and normal lung tissues were significantly different(P<0.05).In NSCLC tissues,the positive expression of P-ACC was significantly associated with tumor size(P<0.05),but was not significantly associated with lymph node metastasis,clinical stage,and pathological type.We found no correlation between the positive expression of COX-2 and tumor size,lymph node metastasis,clinical stage and pathological type.Further analysis revealed that the positive expression of P-ACC and COX-2 in NSCLC was significantly and negatively correlated(r=-2.37,P=0.032).Conclusion:The positive expression of COX-2 in NSCLC greatly increased compared with that of P-ACC,and a significantly negative correlation was observed between them.We propose that the positive expression of P-ACC reduction may activate the positive expression of COX-2 and promote the occurrence,development,invasion,and metastasis of NSCLC.

non-small cell lung cancer,P-ACC,COX-2,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.20131266

江西省贛州市腫瘤防治研究所（江西省贛州市341000）

李韶今 lsj1362@126.com

（本文編輯：周曉穎）

李韶今 教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事胸部腫瘤的臨床和基礎研究。

E-mail：lsj1362@126.com