活體自發光成像監測長春瑞濱納米膠束抗乳腺癌轉移機制研究*

張發云 秦 蕾 梁 偉

活體自發光成像監測長春瑞濱納米膠束抗乳腺癌轉移機制研究*

張發云 秦 蕾 梁 偉

梁偉 教授，博士，現任中科院生物物理研究所研究員，博士生導師。2000年于上海醫藥工業研究院獲藥劑學博士學位。2000～2004年，先后在美國明尼蘇達大學、哈佛大學醫學院、東北大學從事博士后研究工作。現任蛋白質與多肽藥物實驗室副主任、中國生物物理學會第九屆理事會理事、中國生物物理學會分子影像學專業委員會副主任委員、中國藥學會藥劑專業委員會委員、《納米科學與技術》叢書編委會編委等職。主要研究藥物新型輸送系統和藥物新靶標的發現。提出并實現了利用膠束運載抗腫瘤藥物到達實體瘤內部深層細胞，提高了藥物的療效、降低了毒副作用，為臨床腫瘤治療提供新的策略；發現組織纖維化為腫瘤細胞的生成和發展提供了有利的微環境,促進腫瘤生長和轉移，TGF-β/Smad3信號通路在這一過程中起到關鍵作用并作為藥物篩選的新靶點。主持項目包括國家新藥創制重大專項、科技部973、重大科學研究計劃等。研究成果入選2007年“中國科技十大進展新聞”，獲2008年中國藥學會科學技術獎（二等獎）、2010年第十二屆中國專利優秀獎、2012年國家自然科學獎（二等獎）。授權發明專利9項，在JNCI、ACS Nano、Cancer Res等國際重要刊物發表研究論文40余篇。

目的：乳腺腫瘤細胞的轉移是乳腺癌致死的主要原因。淋巴轉移作為血道和淋巴兩大轉移途徑之一，在乳腺癌轉移過程中至關重要。針對乳腺癌轉移的特點，本研究組設計了具有淋巴富集特性的納米載藥系統，活體動態監測其對原位乳腺腫瘤生長以及肺臟和淋巴器官轉移的抑制效果，旨在為臨床用藥提供科學依據。方法：采用活體自發光成像實時動態地監測了聚乙二醇化磷脂（PEG-PE）包載的長春瑞濱納米膠束抗乳腺癌體內轉移的過程。結果：與未包載的游離長春瑞濱（Free Vin）相比，PEG-PE包載的長春瑞濱膠束（NanoVin）增強了長春瑞濱的抗原位瘤活性，顯著抑制了乳腺腫瘤細胞的淋巴及肺臟轉移。結論：通過靜脈給藥達到了血道轉移和淋巴轉移兩條途徑的雙重清掃，為靶向藥物設計提供了新思路。活體光學成像技術可動態監測腫瘤的轉移，為臨床應用影像技術檢測藥物療效提供必要的技術手段。

長春瑞濱納米膠束 活體光學成像 乳腺癌 淋巴轉移

腫瘤轉移是腫瘤細胞從原發部位經過一系列步驟到達宿主遠端組織或器官后得以繼續生長，形成與原發腫瘤相同性質的繼發腫瘤的過程［1］。臨床數據表明，90%的腫瘤患者最終死于轉移［2］。因此，研究開發抗腫瘤轉移的藥物尤為重要。

淋巴轉移和血液轉移是腫瘤轉移的兩個主要途徑。在乳腺癌等多種實體瘤中，腫瘤早期通過淋巴轉移［3］。在腫瘤晚期，則會發生血液轉移。因此，抑制這兩個途徑的轉移十分重要。然而，靜脈注射的納米藥物往往粒徑很大，難以被淋巴攝取。而淋巴靶向給藥可以直接被淋巴系統攝取，但對血液轉移抑制作用有限。研究發現，藥物尺寸大小是影響淋巴攝取和淋巴結滯留的重要因素之一［4］。粒徑小于10 nm的粒子被優先重吸收進入毛細血管，而淋巴攝取粒子的最佳粒徑則在10～30 nm之間。納米膠束載藥系統是近年來興起的一類給藥系統。目前，已有膠束制劑處于研發和臨床實驗階段，如Genexol-PM、NC-6004、NK911等［5-7］。本實驗室研究發現，采用嵌段共聚物聚乙二醇化磷脂（PEG2000-PE）包載阿霉素膠束表現出比游離阿霉素更優越的抗原位瘤和轉移效果［8］。繼而本研究對膠束的抗轉移機制進行了考察，發現經PEG-PE包載后的膠束粒徑在14 nm左右，能從正常血管中以完整形式滲出，較游離藥物在淋巴結中滯留更長時間，提示我們該膠束可能具有更好的抗淋巴轉移效果［9］。

活體光學成像技術是近幾年來發展成熟的分子影像新技術，現已被廣泛應用于實時、連續、直觀地觀測活體內腫瘤細胞的生物學行為。為進一步研究PEG-PE包載藥物膠束的抗轉移效果，本研究采用活體自發光成像技術，對膠束包載的長春瑞濱抗乳腺癌的轉移療效進行實時、連續動態的監測，并就載藥膠束抗乳腺癌轉移的機制進行探討，以期深入了解藥物和載體的特性，為開發有效抗腫瘤轉移的新型藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物

鼠源乳腺癌細胞4T1購自ATCC。RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司，細胞培養用胎牛血清購自德國PAA公司。磷脂及其衍生物：PEG2000-DSPE購自美國Avanti Polar Lipids公司。長春瑞濱酒石酸鹽（Vinorelbine tartrate）為浙江民生制藥廠提供。實驗動物雌性BALB/c小鼠，18～20 g，6～8周齡；購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2012-0001］。

1.2 方法

1.2.1 長春瑞濱膠束的制備 將適量PEG2000-PE溶于氯仿，搖勻后旋轉蒸干成脂膜，真空干燥至少1h除盡殘留的有機溶劑。加入去離子水水化脂膜，使得溶液中PEG-PE的濃度為40 mg/mL。55°C水浴水化30 min，室溫靜置2 h使其充分組裝即得到空白膠束儲液。將長春瑞濱酒石酸鹽溶于去離子水制得4 mg/mL的藥物水溶液。將該藥物水溶液與40 mg/mL的空膠束等體積混合，55°C水浴水化30 min，室溫靜置2 h使其充分包載藥物，即制得載藥膠束儲液，所得載藥膠束的藥脂比為1∶10（w/w）。將制得的藥物采用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，備用。

1.2.2 長春瑞濱膠束對原位瘤生長抑制作用的考察 雌性BALB/c小鼠30只，于第四乳腺墊皮下接種4T1-Luc2乳腺癌腫瘤細胞（Caliper Co.）（10萬/只）。接瘤后第4天，采用精諾真活體自發光成像系統（IVIS，Spectrum）檢測其原位腫瘤的光子數。依據光子數平均值相接近且從大到小均散分布的原則對小鼠進行分組，每組10只。在接瘤第5天，采用尾靜脈注射給藥，每周一次，共2次。1）NanoVin治療組：尾靜脈注射NanoVin 10 mg/kg（含Free Vin 10 mg/kg）；2）Free Vin治療組，尾靜脈注射Free Vin 10 mg/kg；3）Control對照組，尾靜脈注射PBS溶液0.2 mL/20 g。于接瘤后第14天和第21天，采用活體光學成像監測原位腫瘤光子數并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%異氟烷氣體麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素（Caliper Life Sciences）。15 min后，采用自發光成像對小鼠進行整體成像。其原位腫瘤部位的光子數采用成像系統光子數測定軟件計量。

1.2.3 長春瑞濱膠束對乳腺癌轉移作用的考察 雌性BALB/c小鼠42只，其接種乳腺腫瘤方法和接瘤后給藥方式均與1.2.1方法相同。按平均光子數相同隨機分為對照組（Control）13只，游離長春瑞賓組（Free Vin）13只，長春瑞賓膠束組（NanoVin）16只。采用活體自發光成像系統監測第14天和第21天小鼠肺部腫瘤轉移部位的光子數并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%異氟烷氣體麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素。15 min后，采用自發光成像對小鼠進行整體成像。為避免原位腫瘤強烈的發光信號對肺部轉移腫瘤發光信號的影響，我們采用黑色不透光袋將原位腫瘤遮住，只針對肺部轉移腫瘤進行成像。其肺部轉移腫瘤部位的光子數采用成像系統光子數測定軟件計量。接瘤第31天，小鼠異氟烷麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素。15 min后，把小鼠斷頸處死，實施肺臟和淋巴結的解剖手術，淋巴結的分離包括腋下淋巴結（左側2～3枚，右側2枚），右側腹股溝淋巴結（1枚）。并對離體的小鼠肺臟和淋巴結進行自發光的成像光子數監測同時成像，其肺部和淋巴結中腫瘤光子數采用成像系統光子數測定軟件計量。

1.3 統計學分析

以SPSS 17.0軟件分析數據，采用單因素方差分析，數據以±s形式記錄。兩組間統計學顯著性差異檢驗采用Student t-test。其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.005。

2 結果

2.1 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生長的抑制作用

為考察長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生長的抑制作用，在乳腺墊原位接種第4天成像并分組。第5天，分別采用PBS，游離長春瑞濱和長春瑞濱膠束給藥治療。在接瘤第14天，第21天采用活體光學成像系統監測小鼠乳腺墊原位的腫瘤光子數。與對照相比，給藥組小鼠的原位腫瘤光子數均有減少。長春瑞濱膠束治療組較游離長春瑞濱藥物治療組減少更明顯（圖1A、B）。此外，第31天原位腫瘤解剖照片也表明長春瑞濱膠束治療組可顯著抑制原位腫瘤的生長（圖1C）。

2.2 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌腫瘤肺部轉移的抑制作用

為考察長春瑞濱膠束對乳腺癌轉移的影響，在接瘤第14天，第21天采用活體光學成像系統監測小鼠肺部腫瘤轉移部位的光子數。結果發現，在接種第14天和第21天，與對照組相比，游離長春瑞濱藥物治療組和長春瑞濱膠束治療組的肺部轉移瘤光子數均有減少，尤以膠束組減少的最多，提示長春瑞濱膠束能有效抑制乳腺癌腫瘤細胞向肺部的轉移（圖2A、B）。同時，第21天肺部轉移腫瘤的自發光成像圖片顯示，對照組中僅有一只肺部未見轉移，而在游離長春瑞濱藥物治療組和長春瑞濱膠束治療組的肺部未見轉移小鼠數量增加，尤其膠束組肺部未見轉移小鼠數量最多（5/16）（圖2C）。第23天肺部解剖照片也顯示長春瑞濱膠束治療組的肺部轉移腫瘤的結節數最少（圖2D）。接瘤第31天，將解剖的肺臟和淋巴結進行成像監測發現，與對照組相比，游離長春瑞濱藥物治療組肺臟平均光子數為2.40×109vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差異為 1.33×109（P=0.33，Independed-samples t test）。長春瑞濱膠束藥物治療組肺臟平均光子數比對照：T/C是0.17（平均值為6.33×108vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差異為3.10×109（P=0.004，Independed-samples t test，圖3A）。解剖分離的肺部自發光成像圖片也顯示與游離長春瑞濱治療組的小鼠肺部和淋巴結轉移瘤相比，長春瑞濱膠束治療組的小鼠肺部的轉移顯著減少（圖3B）。

圖1 光學自發光成像監測長春瑞濱膠束抑制4T1-luc2原位腫瘤光子不同時間成像與增長曲線圖Figure 1 Bioluminescence photon imaging and growth curve of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on 4T1-luc2 primary tumors

2.3 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌腫瘤淋巴結轉移的抑制作用

在前期的預示驗中，我們發現，在乳腺癌原位接瘤后20天后才會出現小鼠淋巴結部位的轉移。因此，本研究中考察了接瘤第31天接瘤小鼠淋巴結的轉移情況。結果發現，對照組淋巴轉移小鼠個體發生率為46.2%（6/13），游離長春瑞濱藥物治療組為30.8%（4/13），而長春瑞濱膠束治療組僅有7.8%（1/13）（圖4B）。而對比發生轉移的淋巴結個數則發現，游離長春瑞濱治療組（9個）＞對照組（7個）＞長春瑞濱膠束治療組（1個）（圖4C）。解剖的三組淋巴結成像如圖4A所示。

圖2 光學自發光成像監測4T1-luc2乳腺癌肺部轉移腫瘤光子量成像圖Figure 2 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung

圖3 光學自發光成像監測4T1-Luc2腫瘤原位接種第31天解剖肺組織的轉移腫瘤光子成像圖Figure 3 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung metastasis of 4T1-luc2 breast cancer on day 31

圖4 光學自發光成像監測4T1-luc2腫瘤原位接種第31天淋巴結解剖成像圖Figure 4 Bioluminescence imaging of lymph node metastases on day 31 after treatment

3 討論

本實驗采用活體自發光成像實時、動態、直觀地考察了PEG2000-PE包載的長春瑞濱膠束抗乳腺癌原位生長和轉移的治療效果，發現長春瑞濱膠束在抑制原位瘤生長、阻止其遠端轉移，尤其是淋巴結的轉移方面表現出明顯優于游離長春瑞濱的治療效果。

目前，針對腫瘤的納米載藥系統一般都是基于EPR理論，即實體瘤組織由于血管內皮細胞間隙大，血管通透性高，且缺乏淋巴回流，造成大分子藥物易透過腫瘤組織血管并在腫瘤組織中有高濃度的滯留累積［10］。故傳統的被動靶向納米制劑為了增加EPR效應，粒徑一般較大，如處于臨床或臨床前研究的膠束制劑Genexol-PM、NK911、NC6004的粒徑分別在90、40、30 nm左右［5-7］。然而最近的研究表明，由于納米制劑的滲出受血管通透性的嚴格限制，在直徑小于2～3 mm的微小腫瘤，如轉移瘤中，由于血管結構相對完好，粒徑在48 nm左右的膠束無法從該處滲出發揮作用［11］。因此，傳統納米載藥系統雖然可以有效控制原位瘤，但對轉移，尤其是淋巴系統的轉移卻不能產生很好的抑制效果。而本研究采用的PEG-PE長春瑞濱膠束粒徑為14 nm，可以從正常血管中以完整形式滲出，較未包載游離藥物更多的在淋巴系統富集［9，12］。本研究通過活體成像實時動態地考察了長春瑞濱膠束抗乳腺癌轉移的效果，直觀有力地證明了長春瑞濱膠束能有效殺死血液和淋巴系統這兩條路徑中轉移的腫瘤細胞，因此比游離藥物有更好的抗轉移效果。

本實驗組已有研究表明，化療藥物經PEG-PE膠束包載后，在提高抗腫瘤活性的同時降低藥物對機體的毒副作用。PEG-PE膠束包載阿霉素后能明顯降低阿霉素的心臟毒性［8］。本研究中NanoVin只增加了對腫瘤細胞的細胞毒作用，而對正常細胞無毒性。NanoVin這種選擇性的細胞毒作用有助于它殺死腫瘤細胞并降低機體毒性［12］。NanoVin的低毒性也反映在其半數致死劑量LD50相比游離長春瑞賓增加了70%［9］。此外，NanoVin具有較小的骨髓抑制性，對注射部位的組織和血管非常低的刺激性，并大幅度的減少長春瑞賓對CYP3A4活性的抑制。NanoVin的這些特性均表明其減少了長春瑞賓藥物的毒副作用。

在本文中我們采用活體自發光成像技術考察了膠束包載藥物對抗轉移效果的影響。活體自發光成像因具有敏感性高，抗干擾能力強，以及穿透力強的特點被廣泛應用于腫瘤細胞的侵潤和遷移檢測，尤其是微轉移灶的檢測上［13］。通過對同一組小鼠在不同時間點進行記錄，直觀動態地監測乳腺癌的生長并跟蹤腫瘤的轉移，使實驗有很好的連續性，因此數據更加真實可信。我們對膠束包載的長春瑞濱抗乳腺癌轉移的療效進行了實時、連續動態的監測，為開發有效的抗乳腺癌轉移的新型納米藥物提供了新的思路。

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（2013-09-26收稿）（2013-10-11修回）

Monitoring anti-metastasis effect of vinorelbine-encapsulated micelles on breast cancer by bioluminescence imaging

Wei LIANG;E-mail:weixx@sun5.ibp.ac.cn
Protein and Peptide Pharmaceutical Laboratory,Institute of Biophysics,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100101,China.

Objective:Breast cancer metastasis is a major cause of death.Lymphatic metastasis is one of the two main metastatic ways that is crucial to the metastasis process of breast cancer.To treat breast cancer metastasis,we prepared micelle-based drug carrier for lymphatic delivery.Methods:We used in vivo bioluminescence imaging for real-time dynamic monitoring of the inhibitory effect of polyethylene glycol phospholipid micelle encapsulating vinorelbine on breast cancer metastasis.Results:Compared with the free vinorelbine,vinorelbine-encapsulated micelles(NanoVin)showed a significantly enhanced anti-tumor activity both in primary and metastatic tumors.Conclusion:Intravenous administration of NanoVin markedly prevented the metastasis of tumor cells through both hematogenous and lymphatic systems.This study provides a new approach for treatment of metastatic tumors.Bioluminescence imaging is a powerful tool to dynamically monitor tumor metastasis and clinical therapeutic effect of anticancer drugs.

vinorelbine-encapsulated micelle,bioluminescence imaging,breast cancer,lymphatic metastasis

中國科學院生物物理研究所，蛋白多肽藥物實驗室（北京市100101）

*本文課題受國家重大科技專項973計劃項目（編號：2011CB707705）資助

梁偉 weixx@sun5.ibp.ac.cn

10.3969/j.issn.1000-8179.20131858

Fayun ZHANG,Lei QIN,Wei LIANG

This work was supported by The State Key Development Plan Project(No.2011CB707705).

（本文編輯：鄭莉）