不同劑量痰熱清對急性肺損傷大鼠肺勻漿內炎癥因子的影響

廣州市中醫醫院，廣東 廣州 510130

不同劑量痰熱清對急性肺損傷大鼠肺勻漿內炎癥因子的影響

林宏范小紅陳群雄張智琳

廣州市中醫醫院，廣東 廣州 510130

目的觀察不同劑量痰熱清對ALI大鼠肺勻漿內炎癥因子的影響。方法雄性Wistar大鼠72只，隨機分為4組，包括正常對照組(A組)、ALI模型組(B組)、常規劑量組(C組)、高劑量組(D組)，每組18只。后三組大鼠經尾注射脂多糖復制ALI模型。30min后經腹腔注射生理鹽水、2.1ml/kg與4.2ml/kg的痰熱清，每天給藥1次，連續3d。每次給藥后6h將每組的6只大鼠處死，取肺組織制成肺勻漿，檢測MMP-9、 TNF-α、IL-6含量，并在光鏡下觀察肺組織病理變化。結果C、D兩組與B組相比，肺勻漿MMP-9、TNF-α、IL-6含量有顯著下降(P<0.05或P<0.01)， C、D兩組之間差異不具有統計學意義(P>0.05)，而D組大鼠出現不良反應和死亡的情況較C組多。光鏡下B組呈現ALI病理改變， C、D兩組較B組有明顯改善，兩組間差異不具有統計學意義。結論痰熱清可以降低ALI大鼠肺勻漿內的炎癥因子水平，常規劑量和高劑量效果相當，但高劑量可能會導致不良反應增加。

急性肺損傷；痰熱清注射液；大鼠；炎癥因子

Ashbaugh于1967年首次對急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)進行了報道，雖然是臨床常見的嚴重性呼吸急癥，但目前臨床尚未明確其發病機制，有資料顯示多種炎癥因子在其發病過程中起重要作用。臨床治療上，西醫尚無特異療法，多給予液體復蘇、呼吸管理、原發病治療及感染控制治療。

祖國傳統醫學雖然沒有關于急性肺損傷的記載，但根據急性肺損傷的臨床癥狀，應當屬于“喘證、喘脫、暴喘”范疇。既往研究表明，中醫藥治療急性肺損傷尚有一定療效[1]。痰熱清注射液是金銀花、黃岑、連翹、羚羊角及熊膽粉等組成的中成藥，有清熱解毒、化痰解痙的作用，臨床應用發現痰熱清注射液對炎癥因子有降低作用，可以減輕患者炎癥反應，對肺部病理改變進行改善，對ALI有一定療效[2]。本研究采取連續給藥3d的治療方式，對比觀察不同劑量下痰熱清對急性肺損傷大鼠肺勻漿液MMP-9(基質金屬蛋白酶9)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、IL-6(白細胞介素6)水平的影響，統計不良發應，現具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 研究選用的動物為中山大學實驗動物中心的雄性SPF級Wistar大鼠，共72只，體重180～220g。

1.2 實驗試劑 選取美國Rapidbio(RB)公司的ELISA試劑盒作為MMP-9試劑盒。

1.3 分組實驗方法 將實驗大鼠隨機分為四組：A組(正常組)，B組(急性肺損傷模型組)，C組(常規劑量組)，D組(高劑量組)，每組各18只。

1.4 實驗模型制備 A組大鼠經尾靜脈注射2ml/kg的生理鹽水，B、C、D三組均靜注5mg/kg脂多糖復制AIL模型。0.5h后經腹腔注射藥物，A組生理鹽水、B組生理鹽水、C組2.1ml/kg痰熱清(上海凱寶藥業有限公司，國藥準字Z20030054，20ml/支)、D組4.2ml/kg痰熱清。每天早上注射1次，連續3d。所有大鼠用藥劑量均按人的臨床用藥劑量折算。

1.5 實驗取樣 每次注射6h后，每組隨機選取6只大鼠經腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛進行麻醉(注：A組第1d處死的大鼠為A1組，B組第1d處死的大鼠為B1組，A組第2d處死的大鼠為A2組，以此類推)，大鼠麻醉后行股動脈放血處死，開胸取1cm×1cm×1cm左肺中葉組織塊，10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切片后HE染色，經光鏡對其形態學改變進行觀察。另開胸取右肺中葉1g，加入9ml生理鹽水，冰浴中勻漿30秒，于4攝氏度下3500rpm離心0.5h，取離心后上清液分裝凍存，以此作為嚴重指標進行檢測。

1.6 檢測方法 應用ELISA法對大鼠肺勻漿MMP-9、TNF-α、IL-6水平進行檢測。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況 B組第1天死亡1只。C組第2天死亡1只。D組第1、2、3天各死亡1只。B、C組死亡率為5.6%，D組為16.7%。實驗過程中，D組大鼠大部分大便稀溏、次數增多。

2.2 各組大鼠肺勻漿的MMP-9、TNF-α、IL-6含量分別見表1、表2和表3。

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05。

表2 各組大鼠TNF-α水平(ng/l)

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05，##P<0.01;與B1比較，△P<0.05;與C1比較，☆P<0.05；與D1比較，▲P<0.05。

表3 各組的IL-6含量(ng/L)

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05，##P<0.01;與C1比較，△P<0.05。

2.3 光鏡下肺組織病理改變情況 A組：大鼠肺組織呈粉紅色，表面完整且光滑，可見完整的肺泡與支氣管組織。

B組：大鼠肺組織表面有分數的點、片狀出血壞死灶，標本切面有大量粉紅色液體溢出，光鏡下觀察發現肺間質有充血、水腫癥狀，肺泡間隔增寬，肺毛細血管充血擴張，肺泡部分融合，肺泡腔內、肺間質有炎性細胞浸潤現象，多中性粒細胞，少量淋巴細胞，有局灶性紅細胞滲出。

C組：大鼠肺組織表面與B組大鼠相同，但范圍小于B組。C1組大鼠光鏡下實變范圍、炎性細胞顯著減少，肺泡內滲出性紅細胞無減少。C2組大鼠光鏡下肺實變范圍減少明顯，肺泡內滲出性紅細胞少量增多。C3組大鼠光鏡下肺實變范圍、炎性細胞、滲出紅細胞均少于其他兩組。

D組：大鼠肺組織表面同B組。光鏡下肺實變范圍與C組相似，肺間質有充血、水腫癥狀，肺泡腔內、肺間質多炎性細胞浸潤，多中性粒細胞，無成堆分布，局灶性紅細胞滲出。D1～D3組病變依次減輕，其中D2、D3組細支氣管、血管旁肥大細胞較多。

3 討論

MMP-9是MMPs家族中重要的成員，是Ⅳ型膠原，主要分解基底膜，是構成毛細血管內皮及肺泡上皮細胞基底膜的主要成分，在基底膜損傷中有重要意義[3]。臨床多項研究發現，痰熱清可對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液MMPs活性進行誘導以促使其升高，而且MMP-2與MMP-9的活性變化與肺病理形態學積分顯著相關，并對肺間質及肺泡水腫的形成有促進作用，對痰熱清誘導的過程中有重要意義[4]。TNF-α是早期主要的前炎癥因子之一，它主要通過直接損傷內皮細胞、激活中性粒細胞聚集、抑制肺表面活性物質的形成等途徑參與ALI的發生與發展[5]。ALI/ARDS患者的血液與肺部中IL-6水平均明顯高于健康人群，研究同時發現，ALI大鼠肺勻漿與血漿中IL-6水平顯著升高，與肺損傷病變程度呈正相關[6]。

本研究結果表明，C組與D組大鼠指標均于B組差異顯著，說明常規劑量的痰熱清與大劑量痰熱清對肺MMP-9、IL-6及TNF-α均有降低作用，且效果無明顯差異，各組的病理切片亦呈相應改變，這與我們之前的相關研究結果一致[7]。結果還發現，C2組與C1組大鼠TNF-α水平差異顯著(P<0.05)，D3組與D1組大鼠TNF-α水平差異顯著(P<0.05)，說明連續注射2～3d，大鼠TNF-α水平較第1d下降顯著，但而MMP-9與IL-6均未出現類似TNF-α的變化，可能由于TNF-α作為早期前炎癥因子，是炎性反應中釋放最早且最重要的內源性介質[8]。說明痰熱清早期應用對抑制早期體內TNF-α水平、減輕炎癥反應對肺部損害有重要作用。

研究結果還表明，D組大鼠有腹瀉癥狀，組內死亡大鼠數量均高于B組與C組。相關研究資料表明，痰熱清臨床應用不良反應中，消化系統不良反應高達15.8%，5.3%表現為過敏性休克，部分嚴重患者有喉頭水腫的癥狀[9]。所以應注意高劑量痰熱清引發不良反應的現象。

綜上所述，本研究使我們發現常規劑量與高劑量痰熱清對肺部炎癥因子有降低作用，可以減輕肺部炎癥癥狀，但值得注意的事高劑量痰熱清應用的不良反應與死亡率偏高，臨床應進一步關注研究。

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廣州市中醫藥科技項目,項目編號:20122A011008。

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1007-8517(2014)15-0017-02

2014.06.16)