白腐菌產漆酶的發酵條件研究

趙美麗，屈文峰，邊風根，徐曉安

(1.江西省化學工業學校，330012，南昌；2.江西昌九生化農科化工有限公司，330012，南昌)

白腐菌產漆酶的發酵條件研究

趙美麗1，屈文峰2，邊風根1，徐曉安1

(1.江西省化學工業學校，330012，南昌；2.江西昌九生化農科化工有限公司，330012，南昌)

漆酶(E.C.1.10.3.2)是一類含銅的氧化還原酶，其可以催化對苯二酚(也叫氫醌)氧化生成對苯醌，也常被稱為對苯二酚氧化酶。漆酶一般存在于真菌和植物中，由于具有較高的穩定性和較好的底物專一性，在印染和環境有機毒性化合物的降解、專用生物傳感器的構建、以及造紙領域有機廢棄物的生物加工利用等方面具有實際工業應用。考察了白腐菌的培養和產漆酶條件，對白腐菌產漆酶的培養條件和培養基進行了優選。結果顯示，以小麥皮為碳源，硫酸銨和尿素為氮源，白腐菌生長產酶的適宜培養溫度為28 ℃，pH值為3.5～6.0，培養基的C/N比以20合適。當培養基中添加一定的木質素沉淀物和葡萄糖時對白腐菌液體發酵產漆酶具有明顯的促進作用，菌體發酵液中加入10 g/L的葡萄糖、6 g/L木質素時發酵產漆酶的活力達到最大值。

白腐菌；漆酶；C/N比；酶活

0 引言

漆酶(E.C.1.10.3.2)是一類含銅的氧化還原酶，能催化對苯二酚(也叫氫醌)氧化生成對苯醌[1]，因此常被稱為對苯二酚的氧化酶。漆酶一般存在于真菌和植物中，由于有較高的穩定性和較為廣泛的底物專一性，在環境和印染有機有毒化合物的降解、生物傳感器的構建、造紙業廢液的處理和綜合加工利用等領域具有廣泛的應用[2]。尤其對于酚類污染物的處理，作為生物催化劑的真菌漆酶應用前景非常好。

目前漆酶生產主要采用微生物發酵法，工藝方法有固體培養和液體發酵2種方式[3-6]。本實驗采用液體發酵方式，探討培養基組成和發酵條件對白腐菌生長和漆酶生產的影響。

1 材料和方法

1.1菌種

白腐菌(whiterotfungNS8)，南昌大學生命科學學院保藏。

1.2培養基

1.2.1 CPDA培養基(綜合培養基) 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B 110 mg，瓊脂18～20 g，自來水1 000 mL，pH5～6。

1.2.2 發酵培養基(L) 可溶性的淀粉80.0 g，吐溫6.0 g，愈創木酚20 mmol，氯化銨20.0 g，KH2PO48.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，CaCl2·2H2O 4.0 g，VB10.016 g，含微量元素的溶液160 mL，pH為自然。

1.3培養發酵

1.3.1 菌種的培養 在裝有50 mL液體種子培養基的250 mL搖瓶中，放入適量直徑為5 mm的左右的玻璃珠微粒，滅菌后接入白腐菌斜面菌絲體。在180 r/min，30 ℃，恒溫，振蕩培養4 d，制成液體種子液。

1.3.2 搖瓶發酵產酶 在250 mL搖瓶中裝入液體發酵培養基50 mL，滅菌后接入液體菌種(按體積比為10%)，振蕩培養7.5 d。發酵液于4 800 r/min下離心25 min，取其中的上層清液即為粗酶液。

1.4漆酶活力的測定

酶活測定方法—分光光度法。目前國際上比較常用的測定漆酶的酶活的方法是以ABTS為底物來測定，主要是基于：1)ABTS容易溶解于水中，穩定性好，可以在常溫下放置半年；2)測定的反應過程非常簡單，只要ABTS反應后生成陽離子自由基[7]，這種陽離子自由基能在水溶液中較穩定地存在幾小時甚至幾天，并且有明顯的綠色便于測定；3)和漆酶共存時，ABTS的綠色溶液的摩爾吸光系數較高，可以保證測定酶活時具有較大的靈敏度； 4)ABTS在使用中沒有任何的毒副作用[8]。

采用分光光度法測定酶活時，酶活的單位以3種方式來定義：1)每分鐘所氧化的底物為1 mmol[9]；2)每分鐘所氧化的底物為1 μmol[10]；3)每分鐘吸光度的值發生0.001的改變[11]。其中2是定義酶活單位中用得最多的方法，本實驗采用的是第2種方法。在測定漆酶的活力時，根據每分鐘所氧化的底物的1 μmol定義酶活。

計算漆酶的酶活公式為：

式中：B為酶活值；V總，V酶為反應體系中總體積和反應中酶液體積；ε為吸光系數。

漆酶的活力的定義：在一定條件下，每分鐘催化1 μmol的產物生成所需要的酶定義為1單位。

選用漆酶底物為ABTS，總反應混合物為6 mL，其中粗漆酶液200 μL，40 μmol/L ABTS及6 mL緩沖液(pH6.5)，反應時間為15 min，反應溫度30 ℃。取含酶液0.1 mL，加入HAc-NaAc(pH4.6)緩沖液3 mL，混勻，加入ABTS 0.4 mL，放置30 s，每15 s讀取1次420 nm下吸光值，共讀取6個數值。根據數據判斷，如果吸光度的值增長迅速，則將酶液稀釋2～5倍再次測定，直至吸光度數值變化不大，并且吸光度的值在0.2～0.8之間。

酶活的計算：吸光度變化的斜率×4 000×稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1C/N比對產漆酶的影響

C/N比是產酶過程中培養基的重要影響因素，通過實驗尋找最佳的C/N比。本實驗以小麥皮做碳源，改變初始培養基中的氮源(尿素和硫酸銨)用量，分析不同C/N比對白腐菌產漆酶的影響，實驗結果如表1。

從表1可知，C/N比在逐漸增大的過程中，漆酶的活力表現為先上升后下降。當C/N比為20時，漆酶的活力和產率均達到最高，分別為4 391.9IU/mL和639.5 IU/mL·d。

2.2pH值對產酶的影響

在產酶過程中，pH值的大小可以影響的方面較多，如營養物質的狀態、菌體細胞膜的穩定性及細胞膜對所需物質的吸收能力等方面。本實驗在pH為2.0～8.0范圍內取若干點進行實驗。

表1 C/N對產漆酶的影響

分別配制pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的液體產酶培養基。接種后培養，分析結果如圖1所示。從圖1中可以看出，在pH值大于7時，生產漆酶的活力很低，當培養基的pH值控制在3.5～6.0時，生產漆酶的活力較高。為了操作簡便和對細菌污染的抑制，底物溶液以略偏酸為宜，選擇初始pH值為4時，漆酶分泌能力較強。

圖1 pH值對產酶的影響

2.3培養溫度對產酶的影響

環境溫度也是影響真菌產酶的因素，如果溫度太高或太低，都不利于酶的生產。檢測白腐菌產酶最適溫度在25～40 ℃溫度范圍內進行實驗，用標準方法測定酶活。實驗檢測結果如圖2所示。從圖2看出在不同溫度下液體發酵產酶的活力有明顯差異。在30 ℃條件下，漆酶的活力在培養第9天時達到4 480.8 IU/mL。當溫度控制在28 ℃，在第9天時漆酶的活力達到4 838.3 IU/mL。

從圖2中可以看出，最佳的培養溫度為28 ℃。溫度過高或過低都會影響漆酶的分泌。產酶過程中最高峰出現在第9天，然后下降。這種現象可能因為在培養初期，隨著培養時間的延長，菌種的數量不斷增多，漆酶產量也跟著不斷提高，在第9天時分泌漆酶的量達到最大；但培養時間繼續延長時，培養液中營養物質卻逐漸缺少，菌種的代謝能力下降，使得漆酶的產出能力下降。

圖2 培養溫度對白腐菌分泌漆酶的影響

2.4底物對白腐菌產漆酶的影響

2.4.1 木質素沉淀物的用量對白腐菌產漆酶的影響 木質素是一種漆酶的天然底物，利用木質素沉淀物作為底物進行發酵產酶，正好可以廢物利用、治理環境污染，而且直接降低漆酶的生產成本。

在搖瓶發酵液中分別添加不同量的木質素沉淀物發酵生產漆酶，7 d后檢測酶活力，實驗的結果如表2所示，可以看出添加木質素沉淀物對白腐菌產酶有一定的促進作用。在一定的濃度下，漆酶的活力隨著木質素沉淀物量的增加逐漸升高。當木質素沉淀物的添加量為6 g/L時，生產漆酶的酶活達7 055.3 IU/mL，比沒有添加木質素沉淀物的發酵產酶活力提高5.0倍。再增加木質素沉淀物的量，發酵產酶的酶活的變化不大。

表2 木質素用量對白腐菌產酶的影響

2.4.2 葡萄糖的用量對白腐菌漆酶產量的影響 由于木質素是一種高分子的化合物，一般的微生物是不能直接利用的，所以常常會在培養基中加入適量的葡萄糖，這樣能促進早期菌絲體的生長，使得漆酶的產量能在發酵的后期得到明顯提高。實驗結果如圖3所示。從圖3中可以看出，當發酵液含有木質素沉淀物的量為6 g/L，葡萄糖的添加量在10 g/L比較適合。如果加入的葡萄糖的量不足時，菌絲體生長緩慢而導致它在后期產出酶的酶活偏低，但加入過量的葡萄糖，會使菌絲體早期過度的生長,對后期漆酶的合成也不利。

圖3 葡萄糖用量對白腐菌產酶的影響

3 結論

以小麥皮為白腐菌產漆酶的碳源，硫酸銨和尿素為氮源，比較合適的C/N比是20。白腐菌發酵生產漆酶的適宜培養溫度為28 ℃，pH值為3.5～6.0。發酵液培養基添加木質素沉淀物和葡萄糖對白腐菌發酵產漆酶具有明顯的促進作用，當木質素加量為6 g/L，葡萄糖添加量為10 g/L時，白腐菌液體發酵的菌體生長和發酵液中漆酶的產量得到明顯提高。

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FermantationConditionsofWhiteRotFungiforLaccaseProducing

ZHAO Meili1,QU Wenfeng2,BIAN Fenggen1,XU Xiaoan1

(1.Jiangxi Chemical Industry School,330012,Nanchang,PRC;2.Nine Chang Jiangxi Agricultural Chemical Co.,Ltd.,330012,Nanchang,PRC)

Laccase (E.C.1.10.3.2) is a kind of containing copper oxidoreductase,it could to catalyze hydroquinone oxidation,also be known as hydroquinone oxidase.Laccase exists generally in fungi and plants.Because it has high stability and broad substrate specificity,so be used widely in the toxicant degradation,biosensors, and paper industry.The white rot fungi culture and laccase producing condition had been investigated.The experiment result showed that the wheat skins and ammonium sulfate/urea were the appropriate carbon source and nitrogen source respectively for white rot fungi growth and laccase produced.The optimum conditions were as following:the C/N=20,culture temperature 28 ℃ and pH 3.5～6.Addition of lignin precipitate and glucose has obvious effect on white rot fungi laccase production in liquid fermentation.when the lignin precipitate content reached 6 g/L and glucose 10 g/L in fermentation broth,the laccase activity produced reached maximum.

white rot fungi;laccase;C/N;enzyme activity

2014-06-06;

2014-08-06

趙美麗(1973-)，女，江西永修人，碩士，主要從事儀器分析及食品分析工作。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.04.025

TQ925

A

1001-3679(2014)04-0527-04