卵黃替代血清檢測產蛋鴨高致病性禽流感免疫抗體水平的可行性研究

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(寧波市江北區畜牧獸醫站，浙江寧波 315020)

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卵黃替代血清檢測產蛋鴨高致病性禽流感免疫抗體水平的可行性研究

范文穎，周寅，顧祥國

(寧波市江北區畜牧獸醫站，浙江寧波 315020)

為探討以卵黃替代血清檢測產蛋鴨高致病性禽流感免疫抗體水平的可行性，對小群體試驗鴨，每隔7 d采集卵黃樣品和對應的血清樣品，持續3個月，以HI方法檢測兩者高致病性禽流感病毒疫苗(H5 RE-6株)免疫抗體水平，對檢測結果進行差異性及相關性研究。結果表明，卵黃與對應的血清免疫抗體水平差異不顯著，具有較強相關性。同時進行田間大樣本檢測，從30家蛋鴨養殖戶每家隨機采集30枚蛋和20份全血樣品，對檢測結果進行kappa檢驗，表明卵黃和血清對判定群體免疫抗體水平具有一致性。

卵黃；禽流感；免疫抗體；蛋鴨

我國規定對養殖禽類的高致病性禽流感實行強制免疫，檢測高致病性禽流感免疫抗體是基層動物防疫監督部門的重要工作。一般通過檢測禽類血清中高致病性禽流感抗體水平，進行免疫效果評估。這種方法在采血時必須對家禽進行抓捕、穿刺抽血等操作，易對蛋禽造成驚嚇等應激而引起群體性產蛋量降低，使養殖戶蒙受經濟損失，養殖戶普遍不愿配合，且費時費力，采樣效率不高。

本研究使用經篩選后的鴨卵黃禽流感抗體檢測方法(效價與血清抗體較一致)對小群體試驗鴨和田間樣本的卵黃分別進行卵黃抗體效價檢測，并與血清抗體效價進行相關性和一致性檢驗，以確定用檢測卵黃抗體代替血清抗體對產蛋鴨進行高致病性禽流感免疫評估的可行性。

1 試驗材料

1.1 疫苗 重組二價禽流感病毒滅活疫苗(H5+H9亞型)。批號：2012043，乾元浩生物股份有限公司鄭州生物廠生產。

1.2 HI試驗用抗原和血清 高致病性禽流感病毒(H5N1亞型RE-6株)抗原和血清。哈爾濱維科生物技術開發公司生產，批號為20130218。

1.3 試驗動物

1.3.1 從寧波江北區某種鴨場選取個體差異不顯著的產蛋鴨20羽(180日齡)，經H5N1禽流感疫苗三次免疫，放入試驗鴨舍采用常規方法飼養，作為小群試驗鴨。

1.3.2 寧波市江北區30家存欄蛋鴨2000羽以上蛋鴨場中的產蛋鴨群(紹興麻鴨)，每家隨機采集蛋30枚和全血樣品20份，進行田間大樣本檢測。

1.4 儀器及試劑 96孔V型微量反應板、微量移液器、漩渦震蕩器、微量振蕩器、離心機、無菌采血器等及1%雞紅細胞懸液，生理鹽水。

2 試驗方法

2.1 樣品采集 試驗蛋鴨于180日齡(產蛋穩定)開始采樣，每隔7 d采集1次血清，每天收集鴨蛋，采血當天產蛋作為檢測用蛋(20枚)。試驗期3個月，至260日齡左右結束，共采樣12次。

田間大樣本采自30家蛋鴨養殖場，每場隨機采集當天產的鴨蛋30枚和全血樣品20份，編號記錄，要求按場戶對應。

2.2 樣品制備

2.2.1 血清樣品制備 無菌采集蛋鴨翅或肢靜脈血，靜置后吸取析出血清。保存待檢。

2.2.2 卵黃樣品制備 將卵黃與蛋清分離，用無菌采血器刺破卵膜，直接從卵黃囊抽取卵黃。將采集的卵黃與等量生理鹽水作1∶1稀釋，混合制成卵黃檢樣備用。

2.3 HI抗體效價測定 血清樣品按《GB/T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術》規定方法檢測。卵黃生理鹽水稀釋樣品參照血清樣品進行HI效價測定。

3 結果與分析

3.1 小群體試驗鴨卵黃與血清HI抗體效價的差異性比較 詳見表1。

表1 小群體試驗鴨卵黃與血清HI抗體效價結果

由表1可見，在單獨籠養試驗點的240組蛋鴨卵黃與對應血清HI抗體效價檢測中，卵黃與血清抗體滴度相差在±1log2以內的有230組，符合率在95%以上。利用spss12.0軟件對12批次的數據進行t檢驗，差異不顯著(t0.05)。據試驗可知，在產蛋鴨180～260日齡內，卵黃抗體與血清抗體差異不顯著，可以采用卵黃替代血清進行免疫抗體檢測。

3.2 小群體試驗鴨卵黃—血清抗體效價消長規律及相關性分析 詳見圖1。

圖1 小群體試驗鴨卵黃與血清HI抗體效價結果

由圖1可見，試驗期間卵黃與血清抗體效價均值較為接近，同升同降，曲線變化較為一致，利用spss12.0軟件進行相關系數分析(r=0.63>r0.05，P<0.05)，表明兩者具有強相關性。

在整個試驗期間，卵黃和血清抗體效價均維持在較高水平(>5log2)，表明經過三免高致病性禽流感疫苗后的有效抗體維持水平可達260日齡后，基本覆蓋了整個產蛋期。

3.3 田間大樣本檢測對兩種方法的一致性檢驗 詳見表2。

表2 田間大樣本檢測卵黃與血清抗體陽性率檢測結果

由表2可見，以陽性率70%以上作為群體免疫合格標準，對30家養殖場數據進行整理歸類，經一致性kappa檢驗(k=0.782>0.75)，表明在不同產蛋期間用卵黃抗體的陽性率評估蛋鴨群體免疫合格與血清評估具有良好的一致性。

4 結果與討論

不少國內學者對卵黃抗體效價與血清抗體效價的相關性進行過初步研究，孟艷等(2007)[1]、席文平等(2007)[2]研究均認為蛋雞卵黃抗體效價與血清效價的差異不顯著，具有相關性。但有關蛋鴨卵黃與血清抗體相關性研究報道甚少，本研究可為卵黃取代血清作為蛋鴨禽流感抗體檢測樣本提供了依據。

實際操作中，卵黃樣品需經制備才能用HI方法檢測。研究者利用很多方法對卵黃樣品進行提純制備，如氯仿萃取法[3]、PBS直接稀釋法[4]、PEG沉淀法[5]。從抗體檢測簡便實用角度出發，筆者經過篩選，采用生理鹽水直接稀釋卵黃樣品，檢測效價與血清效價差異不顯著，且重復性良好。

據黃建文等(2004)[6]報道，在蛋雞禽流感疫苗免疫后的21 d內不適宜采用卵黃替代血清監測禽流感抗體，因為卵黃中抗體產生較血液中抗體產生滯后。但在養殖戶實際飼養過程中，很少在產蛋期間進行免疫接種，一般均在開產前1個月就已做好三免工作。因此，在實際檢測工作中無論在產蛋初期、中期、還是后期，均可采用卵黃替代血清檢測禽流感抗體。

本次試驗利用統計學方法對小群體試驗鴨的卵黃與對應血清的免疫抗體效價進行分析，發現兩種抗體效價差異不顯著，具有較強相關性，可以用卵黃替代血清進行檢測。田間大樣本檢測結果表明，在不同產蛋期間實際操作中卵黃和血清對判定群體免疫水平具有一致性，再次驗證了在產蛋期可以采用卵黃替代血清樣品進行檢測。

[1]孟艷，楊秀女，武秋雙，等.蛋禽卵黃和血清禽流感抗體的差異及相關性[J].今日畜牧獸醫，2007,6:3-5.

[2]席文平，李吉軒，岳建新，等.禽流感血清抗體與卵黃抗體消長規律比較研究[J]．中國畜牧獸醫，2007，34(1)：103-105.

[3]鄭立勇，喬彥良，馬鳳龍. 卵黃抗體不同提取方法的比較[J].動物保健品，2009,1:106-107.

[4]康亦兼，咸漠，李文興，等.水稀釋法分離卵黃IgY[J].吉林大學自然科學學報，2001,3：84-86.

[5]閔嗣璠，李彬，萬思平.PEG6000用于卵黃抗體提取條件的初探[J].食品科學，2007，11(28)：241.

[6]黃建文，毛跟年，馬秋明，等.蛋雞血清與卵黃中禽流感病毒抗體的相關性[J].中國獸醫科技，2004,34(5):65-67.

2014-01-15

S858.32

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：1005-7307(2014)03-0006-003