絲裂原活化蛋白激酶與核因子-κB在碳酰氯吸入性肺損傷中的作用

邵義如 申捷 袁震 何岱昆

(復旦大學附屬金山醫院化學傷害醫療救治中心重癥監護室，上海 201508)

碳酰氯(俗稱光氣)作為一種重要的化工原料，全球年產量超過200萬噸。碳酰氯吸入可導致吸入性肺損傷，甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。隨著對碳酰氯吸入性肺損傷的發病機制的研究的深入，將有助于ARDS的早期診斷和特異性治療，對降低碳酰氯吸入性肺損傷患者的病死率也有重要意義。研究[1-2]發現，在內毒素、高氧、燒傷、缺血再灌注及機械通氣等引起的肺損傷中，活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)使轉錄因子如激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等磷酸化，這些轉錄因子再作用于靶基因5'端的一些調控序列(如轉錄因子AP-1結合位點、CAMP反應元件等)，調節基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(inerleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素(inerleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(inerleukin-8，IL-8)等炎性反應因子的表達，從而產生生物學效應，介導炎性反應過程，參與肺損傷的發生、發展。MAPKs包括細胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、蛋白激酶p38和c-氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK) 3種通路蛋白。磷酸化的MAPKs(p-ERK1/2、p-p38、p-JNK)具有活性。前期的研究[3-6]表明，p38、JNK活性蛋白通路在碳酰氯吸入性肺損傷中發揮作用，本研究旨在探討MAPKs與NF-κB在碳酰氯吸入性肺損傷中的作用及相互關系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 固體碳酰氯(浙江省海寧中聯化學有限公司)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF，上海生物工程有限公司)，ERK1/2特異性阻斷劑PD98059、p38特異性阻斷劑SB203580和JNK特異性阻斷劑SP600125(上海碧云天公司)，大鼠NF-κB抗體(上海Santa cruz公司)，Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，考馬斯亮藍試劑盒(上海鈺森生物技術有限公司)。

1.2 動物分組及給藥 40只雄性Wistar大鼠，體質量220～280 g，第二軍醫大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0003，適應性飼養1周。將40只大鼠隨機分為空氣對照組、碳酰氯吸入組、PD98059干預組、SB203580干預組和SP600125干預組，每組8只。空氣對照組吸入空氣，碳酰氯吸入組與3個干預組吸入相同濃度的碳酰氯。3個干預組在暴露于碳酰氯前30 min時給予相應的特異性阻斷劑，PD98059(0.4 mg/100 g)腹腔內注射，SB203580(25 μg/100 g)靜脈注射，SP600125(30 μg/100 g)皮下注射。空氣對照組和碳酰氯吸入組給予等量0.9%氯化鈉液，藥物配制及用藥劑量參照文獻[6]。

1.3 碳酰氯吸入性肺損傷模型的制備及標本的采集 大鼠實驗前禁食24 h，自由飲水。應用德國拜耳健康醫療研究中心提供的定向流動碳酰氯吸入裝置，制備大鼠碳酰氯吸入性肺損傷模型，給予8.33 mg/L的碳酰氯吸入(純度為100%)，染毒時間5 min。大鼠腹腔內注射20%烏拉坦麻醉后，腹主動脈放血處死動物，肺動脈插管后即灌注0.5 mL含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，以去除血管內容物和血漿，取部分肺組織分別行冰凍切片、甲醛固定，其余肺組織投入液氮快速冷凍后-80 ℃保存，以備后續檢測。

1.4 檢測項目

1.4.1 肺組織病理學檢查 取右上葉肺組織，制備切片后HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.4.2 肺組織中NF-κB p65蛋白表達的檢測 采用免疫組織化學二步法，嚴格按照說明書操作，一抗(NF-κB抗體)稀釋比例為1∶100，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)稀釋比例為1∶1000，二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素輕度復染。在顯微鏡下觀察，胞核和(或)胞漿呈現棕黃色的細胞為NF-κB陽性表達的細胞。

1.4.3 肺組織中NF-κB p65蛋白含量的檢測 采用蛋白質印跡(Western blotting)法檢測，用 Quantity one軟件分析蛋白條帶，內參照采用3-磷酸甘油脫氫酶(3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，蛋白含量采用目的條帶校正容積/GAPDH校正容積表示。

2 結 果

2.1 肺組織的病理變化 光鏡下觀察發現，空氣對照組肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡隔無水腫、炎性反應等改變；碳酰氯吸入組出現明顯肺損傷，肺組織結構破壞，肺泡腔、血管旁和支氣管周圍有大量炎性細胞(包括巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞和中性粒細胞)浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡腔內有大量滲出物和透明膜形成，并可見肺間質出血和水腫。應用MAPKs特異拮抗劑預處理后，除PD98059干預組外，SB203580干預組、SP600125干預組的肺水腫明顯減輕，肺泡腔滲出物及炎性細胞量減少，但其病理改變仍較空氣對照組重，見圖1。

2.2 肺組織中NF-κB p65蛋白表達的變化 免疫組織化學染色顯示，空氣對照組肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞見少量NF-κB陽性表達，碳酰氯吸入組NF-κB陽性細胞較多，廣泛分布于肺內多種細胞中，包括肺泡上皮細胞、氣道上皮細胞、胸膜間皮細胞、浸潤炎細胞及間質纖維細胞，且細胞核內NF-κB表達增多；而SB203580干預組、SP600125干預組NF-κB陽性細胞明顯減少，PD98059干預組NF-κB變化不明顯，見圖2。

A：空氣對照組；B：碳酰氯吸入組；C：PD98059干預組；D：SB203580干預組；E：SP600125干預組

A：空氣對照組；B：碳酰氯吸入組；C：PD98059干預組；D：SB203580干預組；E：SP600125干預組

2.3 肺組織NF-κB p65蛋白含量的變化 Western blotting結果顯示，碳酰氯吸入組NF-κB p65蛋白的表達水平較空氣對照組升高，差異有統計學意義(P<0.01)。SB203580干預組、SP600125干預組的NF-κB p65蛋白的表達水平均低于碳酰氯吸入組(P<0.05)。PD98059干預組NF-κB p65蛋白表達量與碳酰氯吸入組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表1。

1: 空氣對照組；2：碳酰氯吸入組；3：PD98059干預組；4：SB203580干預組；5：SP600125干預組

表1 各組肺組織中NF-κB p65蛋白的相對表達量

3 討 論

MAPKs是多種信息傳遞途徑的交匯點和共同通路，在細胞分化、存活、死亡以及機體炎性反應中有重要作用。前期研究[5-6]表明，碳酰氯吸入所致的肺損傷過程中，MAPKs信號轉導通路被激活；應用特異性阻斷劑干預的實驗證實，JNK、p38通路參與了肺損傷。

NF-κB是近年研究較多的一個促炎因子，其在炎性反應的發生及調節中起重要作用[7]。本研究免疫組織化學結果顯示，碳酰氯吸入組肺組織中NF-κB蛋白表達明顯高于空氣對照組；而p38、JNK的特異性阻斷劑SB203580、SP600125干預后NF-κB蛋白表達均低于碳酰氯吸入組，即NF-κB蛋白的表達增減趨勢與p-JNK、p-p38一致；提示在碳酰氯吸入性肺損傷中，JNK和p38可通過調控NF-κB蛋白的表達而發揮作用。

本研究中HE染色結果顯示，與空氣對照組比較，碳酰氯吸入組肺損傷程度嚴重，而特異性阻斷劑SP600125和SB203580干預后肺損傷明顯好轉；Western blotting結果顯示，NF-κB蛋白表達水平變化與肺損傷的嚴重程度相關并受JNK和p38信號蛋白的調控。以上結果進一步證明，在碳酰氯吸入性肺損傷中，MAPKs的激活主要是通過p38、JNK信號通路的活化，調控NF-κB蛋白的表達，進一步調節炎性反應，這是碳酰氯吸入性肺損傷發病機制之一，與其他因素所致肺損傷的研究結果一致。

綜上所述，碳酰氯吸入性肺損傷中，JNK、p38通路可通過調控NF-κB的表達而調節炎性反應，而NF-κB對JNK、p38通路是否存在反饋調節作用，有待進一步研究。

[1]Mukhopadhyay S,Mukherjee S,Smith M,et al.Activation of MAPK/AP-1 signaling pathway in lung injury induced by 2-chloroethyl ethyl sulfide,a mustard gas analog[J].Toxicol Lett,2008,181(2):112-117.

[2]王月蘭,姚尚龍.絲裂原蛋白激酶信號轉導通路在機械通氣相關性肺損傷中的作用[J].中華實驗外科雜志,2006,23(3):331-333.

[3]Shen J,Wang J,Shao YR,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin-1 treatment for phosgene-induced acute lung injury[J].Inhal Toxicol,2013,25(5):272-279.

[4]He DK,Shao YR,Zhang L,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin 1 suppresses NF-κB and p38 MAPK and attenuates inflammatory responses in phosgene-induced acute lung injury[J].Inhal Toxicol,2014,26(3):185-192.

[5]邵義如,申捷,袁震,等.MAPKs信號通路在光氣吸入性肺損傷中的表達及作用[J].中華勞動衛生職業病雜志,2012,30(4):278-283.

[6]邵義如,申捷,李衛,等.磷酸化絲裂原活化蛋白激酶在大鼠光氣吸入性肺損傷中的作用及其與基質金屬蛋白酶9的關系[J].中華燒傷雜志,2013,29(3):261-266.

[7]Tian Z,Li Y,Ji P,et al.Mesenchymal stem cells protects hyperoxia-induced lung injury in newborn rats via inhibiting receptor for advanced glycation end-products/nuclear factor κB signaling[J].Exp Biol Med (Maywood),2013,238(2):242-249.