三七總皂苷對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的大鼠急性彌漫性肺泡損傷的保護(hù)作用

高風(fēng)英 李玉霞 王星海 金文強(qiáng) 陳國(guó)平 劉振威

(1.上海市建工醫(yī)院呼吸科,上海 200083；2. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院呼吸科,上海 200080)

急性彌漫性肺泡損傷(acute diffuse alveolar damage,ADAD)是許多種嚴(yán)重肺損傷的最后結(jié)局，常見于急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥(ALI/ARDS)、肺炎、膿毒癥、腫瘤化療藥物引起的肺部疾病、吸入性肺損傷以及其他急性肺損傷患者。ADAD預(yù)后兇險(xiǎn)，病死率高達(dá)72%,嚴(yán)重危脅患者的生命[1]。目前，治療ADAD的措施多為對(duì)癥支持治療，效果欠佳[1]。近年研究[2]發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷(total saponins of Panax notoginseng,PNS)可改善油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷動(dòng)物模型的呼吸力學(xué)特性，降低血管外的肺水含量，且正壓機(jī)械通氣與PNS有一定的協(xié)同作用。本研究建立了博來霉素誘導(dǎo)的大鼠ADAD模型, 多次給予PNS，然后檢測(cè)大鼠動(dòng)脈血漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平、肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)和蛋白質(zhì)的含量以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒細(xì)胞(PMN)和肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)的數(shù)量，計(jì)算肺組織的含水率，并觀察肺組織的形態(tài)變化,旨在評(píng)估PNS對(duì)ADAD的保護(hù)作用并分析其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 24只健康SD大鼠購(gòu)自上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，體質(zhì)量(276.5±1.5) g , 雌雄各半。將24只大鼠隨機(jī)分為A、B、C組,每組各8 只。A組為健康對(duì)照組，B組為模型組，C組為研究組。

1.2 試劑 人腫瘤壞死因子檢測(cè)試劑盒(日本富士公司原裝進(jìn)口，批號(hào)：20110417)；人超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：20110206)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 AU640型生化分析儀購(gòu)自日本奧林巴斯公司；AXSYM型酶免分析儀購(gòu)自美國(guó)雅培公司；ML780 型生理記錄儀購(gòu)自美國(guó)ADI公司；SF23000 型血球計(jì)數(shù)儀購(gòu)自日本東亞公司；H27500型透射電鏡購(gòu)自日本東芝公司；DX5型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.4 方法

1.4.1 應(yīng)用博來霉素誘導(dǎo)大鼠ADAD模型的方法應(yīng)用地西泮(2 mg/kg)聯(lián)合氯胺酮(25 mg/kg)肌內(nèi)注射麻醉大鼠，固定大鼠后行頸前正中切開，暴露氣管，將頭部抬高45°，在氣管內(nèi)一次性注入博來霉素溶液(5 mg/kg)。注藥完畢后縫合切口，將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，盡量使藥液在肺內(nèi)均勻分布。密切觀察大鼠的呼吸情況，防止窒息。術(shù)后將大鼠置于干燥、溫暖條件下喂養(yǎng),定期消毒喂養(yǎng)場(chǎng)所。

1.4.2 各組大鼠的處理 A組靜脈注射1.5 mL/kg的 0.9%氯化鈉液。B組和C組均應(yīng)用博來霉素誘導(dǎo)ADAD； 模型建立后，B組靜脈注射0.9%氯化鈉液，1.5 mL/(kg·d)，連續(xù)3d；C 組靜脈注射PNS，100 mg/(kg·d)，連續(xù)3d。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.5.1 TNF-α的檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，3組大鼠各取1 mL股動(dòng)脈血液，離心后分離血漿, 冷藏于-70 ℃，按腫瘤壞死因子檢測(cè)試劑盒的說明書檢測(cè)TNF-α的含量。

1.5.2 BALF 中蛋白質(zhì)以及PMN和PAM的檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后切取大鼠左肺, 用40 mL 0～4℃的0.9%氯化鈉液分別灌洗肺和支氣管5次，收集灌洗液；然后，采用瑞氏液染色計(jì)數(shù)法測(cè)定BALF中PAM和PMN的數(shù)量。以1500 r/min的轉(zhuǎn)速將灌洗液離心5 min ,吸出上清液，采用考馬斯亮蘭法檢測(cè)BALF中蛋白質(zhì)的含量。

1.5.3 SOD的含量 嚴(yán)格按照測(cè)試盒的說明書檢測(cè)大鼠肺組織勻漿液中SOD 含量。

1.5.4 肺組織的含水率的計(jì)算 肺組織的含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100% 。

1.5.5 肺的組織學(xué)形態(tài) 摘除大鼠的肺后，取少量肺部組織，在光鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 血漿中TNF-α水平的比較 見表1。

表1 3組大鼠血漿TNF-α水平的比較 ng/L

2.2 BALF 中細(xì)胞數(shù)量和蛋白質(zhì)含量的變化情況

表2 3組BALF 中細(xì)胞數(shù)量和蛋白質(zhì)含量的比較

由表2可知，B、C組BALF 中蛋白質(zhì)含量明顯高于A 組 (P<0.05)，C 組的PMN數(shù)量明顯低于B組 (P<0.01)。說明PNS可以減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠ADAD。

2.3 肺組織SOD含量、含水率的比較 見表3。

表3 3組肺組織中SOD 的含量與含水率比較

2.4 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 肺組織切片經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺泡壁情況，A 組相鄰的肺泡僅間隔薄層的間質(zhì)；B 組肺泡間質(zhì)變厚,有粒細(xì)胞浸潤(rùn),部分肺組織不張；C 組肺泡的間質(zhì)變厚，但粒細(xì)胞浸潤(rùn)的程度明顯輕于B組。 見圖1。

圖1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，×10)

3 討 論

ADAD 后期可引起肺間質(zhì)纖維化和支氣管周圍纖維化，病情嚴(yán)重者可因肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展以及肺實(shí)質(zhì)的廣泛破壞而形成蜂窩肺，導(dǎo)致肺功能發(fā)生嚴(yán)重且不可逆的損害[1]。

有研究[3]顯示，體內(nèi)TNF-α水平升高會(huì)加劇ADAD，且TNF-α水平升高的程度與ARDS 的發(fā)生有關(guān)；抗TNF-α抗體能減輕肺組織的損傷程度，且可有效減少感染和炎性反應(yīng)[4]。本研究顯示，博來霉素誘導(dǎo)建立SD大鼠ADAD模型后，血漿中TNF-α水平較誘導(dǎo)前升高；給予PNS能抑制血漿TNF-α水平升高的程度,說明PNS可能通過干擾TNF-α的合成和釋放而發(fā)揮其對(duì)肺組織損傷的保護(hù)作用。但是，PNS的作用機(jī)制目前尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

有研究[4]指出,PMN在在肺泡腔內(nèi)大量積聚是引起ADAD特征性改變的原因。通過對(duì)BALF中PMN總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，可了解PMN浸潤(rùn)的程度；對(duì)BALF中的蛋白質(zhì)和含水量的測(cè)定可反映肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的程度。本研究顯示，干預(yù)后B組和C 組BALF 中蛋白質(zhì)含量、PMN總數(shù)和含水率均高于A 組，但C組上述指標(biāo)的變化幅度明顯小于B組，說明PNS可明顯改善博來霉素引起的肺組織水腫等ADAD表現(xiàn)。

此外，本研究中B 組SOD 的活性低于A 組，而C 組中肺組織的SOD活性高于B 組，說明PNS能增強(qiáng)SOD 的活性。這提示對(duì)于ADAD,及早應(yīng)用PNS有利于清除體內(nèi)的氧自由基,減少受損細(xì)胞的數(shù)量,從而保護(hù)肺組織。

綜上所述，PNS可以降低血漿中TNF-α水平，減輕PMN浸潤(rùn)和肺水腫程度，清除體內(nèi)氧自由基，有效地保護(hù)肺組織，這對(duì)于搶救ADAD患者具有重要意義。

[1]Sakamoto K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis as the initial presentation of the disease[J]. Eur Respir Rev,2009,18(112):129-132.

[2]張劍鋒，張丹參.三七總皂甙藥理作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(6):472-474.

[3]Bhargava R, Altmann CJ, Andres-Hernando A, et al. Acute Lung Injury and Acute Kidney Injury Are Established by Four Hours in Experimental Sepsis and Are Improved with Pre, but Not Post, Sepsis Administration of TNF-α Antibodies[J]. PLoS One, 2013,8(11):e79037.

[4]Bhargava M, Wendt CH. Biomarkers in acute lung injury[J]. Transl Res,2012,159(4):205-217.