玉米愈傷組織對除草劑的敏感性*

王紅濤，徐 紅，李艷臣

(通化師范學院 生命科學學院，吉林 通化 134002)

玉米是世界第三大糧食作物，其種植面積僅次于水稻和小麥，也是制藥、淀粉、飲料、糖精和酒精工業的重要原料．玉米的品種改良現多集中于品質改良及各種抗性的研究，是進行生物技術研究和創新玉米品種資源的一個良好試驗系統.本實驗通過采用抗除草劑玉米自交系H99的胚性愈傷組織為材料，通過愈傷組織對Basta的敏感性實驗，確定愈傷組織適宜的篩選濃度，并初步確定低濃度除草劑對愈傷組織增長有促進作用，高濃度具有抑制作用．通過本課題研究，可為玉米農作物的合理開發應用提供依據，另外為其新品種的研發提供理論基礎．

1 實驗材料

1.1 供試材料

H99玉米外植體

1.2 培養基

MS、N6、B5、MB、NB、NMB

1.3 實驗試劑

除草劑、酒精、次氯酸鈉、無菌水

1.4 實驗儀器

超凈工作臺、冰箱、溫度計、酸度計、分析天平、高壓鍋、酒精燈 試管、容量瓶、移液管等.

2 實驗方法

2.1 培養基的選擇

將授粉10～14d的H99玉米幼胚分別接種于Ms，N6，B5，MB，NB，NMB六種誘導培養基中，20d后觀察愈傷組織誘導情況，此時多為I型愈傷組織，統計愈傷組織誘導率．計算公式為：愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的量/接種總量．

2.2 玉米胚性愈傷組織的誘導

幼胚接種方法是取授粉后11～14d的H99外植體幼穗，將其撥去最外層數片苞葉，留3～5個苞葉，切去雌果穗頭部無籽粒部分，幼胚長0.8～3.0mm在超凈工作臺上用75%酒精浸泡5～10min后移入5%次氯酸鈉溶液浸泡15～20min，然后用無菌水沖洗3～4次，挑出幼胚長度在1.5mm左右的幼胚接到培養基上，在暗室中培養三周左右產生I型初始愈傷組織，溫度26±1℃，觀察愈傷組織誘導狀況并統計愈傷組織誘導率，每隔20d繼代1次，繼代1～2次后即產生穩定的Ⅱ型愈傷組織，取繼代2～3次的Ⅱ型愈傷組織作為農桿菌轉化的受體材料．

2.3 除草劑的配制

除草劑Basta的原始濃度為13.5g·100mL-1取出2.22mL加47.7mL水稀釋、抽濾滅菌得到6mg·L-1的除草劑母液濃度，在13個含有100mL培養基的錐形瓶中加入0、17、34、51、68、85、102、119、136、153、170、187、204μL的母液得到除草劑濃度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12mg·L-1的篩選培養基．

2.4 愈傷組織的繼代培養

在無菌工作臺上將誘導出的生長旺盛、質地緊密、顏色鮮艷的玉米Ⅱ型愈傷組織用鑷子分散為2～3mm左右的愈傷組織塊，接種于培養皿中，并用電子天平稱量所接愈傷組織的重量，培養兩周后，稱量愈傷組織的重量，計算愈傷組織的增殖指數．

3 結果與分析

3.1 不同培養基對H99玉米愈傷組織誘導的影響

在玉米胚性愈傷組織的獲得中，培養基的選擇尤為重要，只有使培養基適應胚性愈傷組織的要求，才能使好的愈傷組織在長期繼代中保持良好的胚性狀態，從而減少無性系變異并保持較好的胚性．本實驗采用不同培養基對愈傷組織進行誘導，經計算得出結論：N6培養基的胚性愈傷組織誘導率最高．

3.2 玉米愈傷組織對Basta敏感性的測定

將H99的胚性愈傷組織轉接于不同濃度的含Basta的篩選繼代培養基上，26℃培養20d后觀察愈傷組織褐變情況，各設置4次重復，統計結果見表1和圖1．

表1 除草劑濃度對H99愈傷組織褐變率的影響

圖1 愈傷組織篩選率曲線

3.3 除草劑濃度對H99玉米愈傷組織重量增長

將H99的胚性愈傷組織轉接于不同濃度的含Basta的篩選繼代培養基上，26℃培養20天后觀察愈傷組織重量增重情況，各設置4次重復，統計結果見表2．

表1和表2未轉化的試驗結果表明8mg/L的除草劑為梯度篩選濃度．不同Basta濃度下玉米愈傷組織中的積累和組織的增重在加有除草劑的培養基上，隨著除草劑的濃度增大，愈傷組織生長速率明顯下降，愈傷組織褐變率也相應增高，增重指數呈下降趨勢；當Basta濃度為8mg/L時，玉米愈傷組織的重量增長率隨培養基中Basta濃度增加而降低，濃度高于8mg/L時對玉米愈傷組織的分化具有明顯的抑制作用；當Basta濃度為10mg/L、11mg/L及12mg/L時，觀察到大多數愈傷組織已經變褐死亡，重量不再增加．存活的愈傷組織生長較緩慢，部分喪失胚性．試驗中還發現，不同生理狀態下的組織對Basta除草劑的敏感性也不同，生長狀態較好時，耐受性較強，反之較弱．

表2 除草劑濃度對H99玉米愈傷組織重量增長的影響

4 討論

綜上得出，N6培養基的愈傷誘導率和胚性愈傷誘導率最高，并且愈傷組織鮮黃色或淺黃色，愈傷組織表現良好的胚性;其次是NB， MB和Ms培養基，胚性愈傷誘導率也較高，愈傷組織誘導效果最差的是NMB培養基，不但愈傷組織誘導率較低，而且愈傷組織多為水漬狀，并且多褐變．另外影響愈傷組織的誘導因素還有3點：①材料的遺傳基礎或稱基因型的差異；②培養基培養條件、培養方式等外部條件；③外植體的生理條件狀態和發育時期論．