丹參酮ⅡA保護腦梗死大鼠血腦屏障的機制研究

溫 雅，祝春華，王力娜，季 輝，劉 瑩(河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000)

·論著·

丹參酮ⅡA保護腦梗死大鼠血腦屏障的機制研究

溫 雅，祝春華，王力娜，季 輝，劉 瑩
(河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000)

目的探討丹參酮ⅡA對大鼠腦梗死后血腦屏障的保護作用及其機制。方法線栓法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型。實驗采用隨機分組(n=168)，分為假手術組、MCAO組、丹參酮ⅡA大劑量組、丹參酮ⅡA小劑量組。丹參酮ⅡA于術后立即腹腔注射，大鼠24h處死。采用Western Blot和反轉錄-聚合酶鏈反應測定claudin-5蛋白和IgG變化，激光共聚焦顯微鏡觀察雙重熒光標記的claudin-5和IgG在腦組織的分布，并觀察神經功能、腦梗死體積和腦水腫。結果與假手術組比較，MCAO組claudin-5表達明顯減少；大劑量丹參酮ⅡA能夠顯著上調claudin-5，明顯改善神經功能，減輕腦水腫，減小梗死體積，減少IgG滲出，保護血腦屏障。結論大劑量丹參酮ⅡA通過上調claudin-5表達，維持血管內皮細胞緊密連接的完整性，對血腦屏障發揮保護作用，是丹參酮ⅡA治療腦梗死的重要機制

腦梗死；血腦屏障；丹參酮

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.001

血腦屏障破壞是腦梗死后腦水腫形成的主要原因，是導致繼發性腦損傷的重要機制之一[1]，而決定血腦屏障完整性的最主要結構是緊密連接蛋白。Claudin-5是緊密連接蛋白的代表成分，其水平代表了血腦屏障的完整性。增加claudin-5表達的藥物能夠有效保護血腦屏障完整性，減輕腦水腫[1-2]。丹參酮ⅡA是中藥丹參的有效活性成分[3]，能夠抑制炎癥反應和細胞凋亡，廣泛用于治療心腦血管病等[4]。而丹參酮Ⅱ能否保護血腦屏障以及詳細機制有待明確。本研究建立大鼠永久性大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，觀察丹參酮ⅡA對腦梗死后腦水腫和claudin-5表達的影響，探討其對血腦屏障的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 實驗動物：成年雄性健康清潔級SD大鼠168只，體質量250～280g，由河北省實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑和儀器：兔抗claudin-5多克隆抗體(美國SantaCraz)；DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠)；Synergy-HT多功能酶標儀(美國Bio-Tek)；聚合酶鏈反應擴增儀(德國Eppendorf)；熒光定量聚合酶鏈反應儀7500(美國ABI)；OLYMPUSFV10-ASW激光掃描共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.1.3 引物設計與合成：上海生物工程公司合成，引物序列如下。Claudin-5，上游5′-CACAGAGAGG-GGTCGTTGAT-3′，下游5′-ACTGTTAGCGGCAGTTT-GGT-3′；β-actin，上游5'-GCCATGTACGTAGCCAT-CCA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和模型：線栓法建立持續性大鼠右側MCAO模型。隨機將168只SD大鼠分為假手術組、MCAO組、丹參酮ⅡA大劑量(丹參酮ⅡA-H)組、丹參酮ⅡA小劑量(丹參酮ⅡA-L)組，每組42只。假手術組血管分離后不插線栓。丹參酮ⅡA組分別以20mg/kg和10mg/kg于MCAO手術后立即腹腔注射。

1.2.2 神經功能缺失評分：處死之前，單盲采用改良的Longa分級法進行行為學評分。0分，無缺陷；1分，不能伸展對側前肢；2分，對側前肢屈曲；3分，輕度向對側轉圈；4分，嚴重向對側轉圈；5分，向對側跌倒(n=10)。

1.2.3 腦組織含水量測定：大鼠在手術后24h斷頭，迅速取腦。冠狀切開去除額極，雙側取約2mm厚的腦組織，采用干濕法測定腦組織含水量，腦組織含水平=(腦組織濕質量-腦組織干質量)/濕質量×100%(n=8)。

1.2.4 腦梗死體積測定；各組大鼠在相應時間斷頭取腦，均勻切成5片冠狀切片，浸入2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，37℃染色30min后4%多聚甲醛中固定24h。梗死體積百分比=(矯正梗死體積/非缺血側半球體積)×100%(n=6)。

1.2.5Claudin-5表達和IgG熒光滲出：采用WesternBlot檢測claudin-5蛋白表達(n=6)，采用反轉錄-聚合酶鏈反應檢測claudin-5mRNA表達，以β-actin作為內參基因(n=6)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察冰凍腦組織片內claudin-5及IgG的共表達并同時測定滲出IgG的強度(n=6)。

2 結 果

2.1 丹參酮ⅡA改善大鼠MCAO后的神經功能：MCAO組、丹參酮ⅡA-H組、丹參酮ⅡA-L組與假手術組比較，均有明顯的神經功能障礙。與MCAO組相比，TanⅡA-H組的神經功能在24h得到明顯改善(P<0.05)。TanⅡA-L組的神經功能評分雖然低于MCAO組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各實驗組術后24h神經功能評分(n=10)

*P<0.05與其他組比較(單因素方差分析)

Figure1Theneurologicaldeficitsat24hafteroperation(n=10)

*P<0.05vsothergroupsbyANOVA

2.2TanⅡA顯著減輕患側腦水腫：術后24h，與假手術組比較，其余3組患側腦組織有明顯的水腫(P<0.05)；與MCAO組相比，TanⅡA-H組患側腦水腫得到明顯改善(P<0.05)，TanⅡA-L組患側腦水腫改善差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

GroupsWatercontentofipsilateralhemisphereSham?operated77．87±0．17MCAO83．21±0．12?TanⅡA?L81．75±0．06?TanⅡA?H78．60±0．05?# F1．012 P<0．05

*P< 0.05vssham-operated group #P<0.05vsMCAO group byqtest

2.3 TanⅡA顯著減小腦梗死體積：假手術組未見缺血病灶，MCAO組、TanⅡA-L組和TanⅡA-H組均有大小不等的缺血性病灶。TanⅡA-H組與MCAO組比較，缺血性病灶體積明顯減小(P<0.05)。見表2。

GroupsInfarctvolumeMCAO51．00±0．75TanⅡA?L47．54±3．96TanⅡA?H28．57±1．07? F2．375 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

2.4 TanⅡA上調claudin-5表達：與假手術組比較，MCAO組腦缺血后24h時claudin-5蛋白表達水平明顯下降；與MCAO組比較，TanⅡA-L和TanⅡA-H均能夠顯著上調claudin-5表達(P<0.05)。見表3。

GroupsClaudin?5proteinClaudin?5mRNASham?operated0．26±0．071．12±0．11MCAO0．13±0．010．60±0．13TanⅡA?L0．31±0．05?1．39±0．28?TanⅡA?H0．31±0．72?1．44±0．32? F2．1052．331 P<0．05<0．05

*P< 0.05vsMCAO group byqtest

2.5 TanⅡA減少IgG熒光滲出：與MCAO組比較，TanⅡA-H能夠顯著減少IgG的滲出，而TanⅡA-L作用不明顯。見表4。

GroupsImmunofluorescentintensityofIgGMCAO1811．16±185．25TanⅡA?L1607．52±177．40TanⅡA?H1168．72±160．04? F2．874 P<0．05

*P<0.05vsMCAO group byqtest

3 討 論

血腦屏障結構包括血管內皮細胞和緊密連接蛋白、基底膜以及血管周圍的星形膠質細胞的終足。緊密連接蛋白的作用是連接血管內皮細胞，是決定血腦屏障的完整性的關鍵性結構[1-3]。其中，claudin-5是最重要的貫穿緊密連接蛋白中的特殊蛋白，大量分布于腦血管內皮細胞[3-4]。

血腦屏障的完整性是保證腦組織內環境穩定的重要基礎[5]。研究[4，6]證明，腦梗死后早期就引起血腦屏障結構破壞，使其通透性增加，是各種炎癥介質、抗體、補體以及血漿蛋白等進入腦實質，引起腦水腫等一系列病理反應的基礎。本研究結果顯示，大鼠腦梗死后24h時，出現顯著的神經功能障礙和腦水腫，血腦屏障完整性破壞，claudin-5表達明顯減少。有研究[1]證明，claudin-5基因敲除后，相對分子質量小于800 000的物質能夠順利通過血腦屏障進入腦組織。而促進claudin-5表達的藥物能夠有效降低血腦屏障通透性[7-8]。

丹參酮ⅡA是從唇形科植物丹參的根中提取分離的二萜醌類化合物,為丹參中的有效成分。近年來研究發現丹參酮ⅡA不僅具有較強的抗菌、抗炎、抗腫瘤活性，還具有抗血小板聚集、抗血栓作用[9]。在腦梗死方面，研究證明丹參酮ⅡA分別通過抑制腦梗死后炎癥反應和細胞凋亡等途徑，能夠有效減小腦梗死體積，減輕腦水腫，具有神經保護作用[10-12]。本研究結果發現，大劑量丹參酮ⅡA(20mg/kg)能夠顯著上調claudin-5蛋白和基因表達，減少大分子物質IgG滲出，減小腦梗死體積，減輕腦水腫，改善神經功能。

綜上所述，丹參酮ⅡA通過上調claudin-5水平，維持血管內皮細胞緊密連接蛋白的完整性，降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫，是其治療腦梗死的部分作用機制。但是，丹參酮ⅡA治療腦梗死以及保護血腦屏障的詳細機制仍需深入研究。

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(本文編輯：劉斯靜)

MECHANISMOFTANSHINONEⅡAPROTECTINGBLOOD-BRAINBARRIERINFOCALCEREBRALISCHEMIAOFRATS

WENYa,ZHUChunhua,WANGLina,JIHui,LIUYing
(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveThisstudyistoexploretheprotectiveroleandmechanismoftanshinoneⅡA(TanⅡA)fortheblood-brainbarrierinfocalcerebralischemiaofrats.MethodsMaleSprague-Dawleyratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).Sprague-Dawleyrats(n=168)wererandomlydividedintosham-operatedgroup,MCAOgroup,TanⅡAhigherdosegroup(TanⅡA-H)andTanⅡAlowerdosegroup(TanⅡA-L).TanⅡAwasadministeredwithintraperitomealinjectionimmediatelyafteroperation,ratswereexecutedat24h.WesternBlot,RT-PCRandconfocalmicroscopewereusedtomeasureclaudin-5proteinandIgGexpressioninischemicbrain.Andtheneurologicaldeficits,brainwatercontentandinfarctvolumewereexplored.ResultsAt24hafterfocalcerebralischemia,claudin-5expressioninMCAOgroupdecreased.Claudin-5inTanⅡA-Hgroupsignificantlyup-regulated,andalsoitsneurologicdeficit,infarctvolumeandbrainwatercontentwerealleviatedcomparedwithMCAOgroup(P<0.05).ConclusionTanⅡA-Hprotectedblood-brainbarrierpermeabilitybyincreasingclaudin-5,whichmightbethemechanismoftreatingfocalcerebralischemia.

braininfarction;blood-brainbarrier;tanshinone

2014-04-02；

2014-07-07

溫雅(1981-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第二醫院主治醫師，醫學碩士，從事腦血管疾病診治研究。

R743.33

A

1007-3205(2014)08-0869-04