骨髓源干細胞移植與中藥聯合治療對大鼠缺血再灌腦損傷的作用

鄧秀君

骨髓源干細胞移植與中藥聯合治療對大鼠缺血再灌腦損傷的作用

鄧秀君

目的 比較中藥與骨髓單個核細胞(BMNC)、骨髓間充質干細胞(BMSC)蛛網膜下腔移植治療缺血腦卒中大鼠腦損傷的作用。方法 147只大鼠隨機分成七組, 為正常組、假手術組、模型組、BMNC組、中藥聯合BMNC組、BMSC組、中藥聯合BMSC組, 每組21只。除正常組和假手術組, 其余組分別移植BMSC和BMNC, 中藥組同時進行中藥聯合治療。分別于移植后4、28 d評定鼠神經功能損傷恢復情況。結果 治療28 d比治療后4 d MMNSS神經功能評分低, 差異具有統計學意義 (P＜0.05)。結論 以相同劑量細胞移植, BMNC對神經功能的修復作用更好, 中藥聯合BMNC移植對缺血性腦梗死神經功能障礙的修復具有協同作用。

骨髓間充質干細胞；骨髓單個核細胞; 中藥；大腦中動脈梗死；蛛網膜下腔；細胞移植；神經功能評分

目前缺血性腦血管病以高致殘率嚴重影響患者的生活,因此近年來腦血管病的研究多以尋找新的治療手段和干預策略為目標。本研究比較中藥聯合骨髓間充質干細胞(BMSC)、骨髓單個核細胞(BMNC) 治療缺血再灌注模型(MCAO)大鼠。應用NSS神經功能評價量表, 評定鼠神經功能損傷后的恢復情況, 找到較適合的中西醫結合治療缺血再灌注的實驗方案,探討缺血性腦血管病的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：Wistar大鼠SPF/VAF級雄性(北京維通利華實驗動物技術有限公司), 共計157只。3～4月齡,體重(270±20)g, 147只；3～4周齡, 體重70～90 g, 10只。主要試劑：胎牛血清、培養基L-DMEM、0.25%胰酶(均源于美國GIBCO公司)；5’-溴脫氧核苷尿嘧啶(武漢博士德公司)；0.9%生理鹽水(沈陽北方制藥廠)大鼠淋巴細胞分離液(中國醫學科學院生物工程研究所)；蝮龍抗栓丸(第二中醫醫院)主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及干預 將3～4月齡的Wistar雄性大鼠, 147只, 隨機分成七組, 每組21只。分為正常組、假手術組、模型組、BMNC組、中藥聯合BMNC組、BMSC組、中藥聯合BMSC組。術后24 h正常組不移植, 假手術組和模型組蛛網膜下腔注射0.1MPBS, 其他組蛛網膜下腔細胞移植(2×107個),中藥組灌胃1次/d, 直至4、28 d取材。147只實驗大鼠, 造模手術死亡10只, 評分不符合剔除11只, 灌胃死亡3只,足趾損傷4只, 最終納入119只, 平均每組17只。

1.2.2 大鼠模型建立 利用Zea Longa改良線栓法［1］, 建立大鼠大腦中動脈栓塞2 hMCAO。Wistar大鼠, 3～4月齡, 腹腔麻醉。鈍性分離暴露右側頸總動脈(CCA), 頸外動脈(ECA),頸內動脈(ICA), 結扎CCA, 在根部結扎ECA, 在CCA近頸內、頸外分叉處剪一小口, 將長度約為4 cm末端燒圓的尼龍線送入ICA內, 深度約為(18±2)mm, 結扎ICA, 堵塞MCA起始端血流。2 h后, 抽出尼龍線, 恢復灌注。麻醉蘇醒后, mNSS評分在6分以上的大鼠為造模成功, 其余剔除。正常組不處理。假手術組大鼠操作至暴露ICA、ECA后簡單剝離即縫合,其余處理同手術組。

1.2.3 干細胞的分離、培養及移植 Wistar雄性大鼠, 3～4周齡, 腹腔麻醉, 取脛骨、股骨。剪開兩端, 用4℃PBS反復沖洗骨髓。離心, 收集單個核細胞層。用含10%胎牛血清L-DMEM細胞培養液培養。24 h后換培養液, 每3天換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長達到80%～90%時, 用胰蛋白酶消化備用。

將培養的BMSCs或BMNCs 細胞制成細胞懸液, 在MCAO模型鼠的枕骨大孔處, 以1 μl/min進行蛛網膜下腔移植, 細胞總數約為2×107個, 體積100 μl。模型組以0.01 MPBS代替。

1.2.4 大鼠神經功能的評定 治療4、28 d對各組大鼠進行評分, 評價神經系統損傷程度。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

術后, 大鼠狀態較差, 體重下降明顯, 3～7 d后逐漸恢復。以模型組表現較典型, 各治療組大鼠恢復較快。與治療后4 d相比, 模型組和各治療組在28 d評分比較, 差異均具有統計學意義(P＜0.05)。評分見表1。注：與模型組相比,aP＜0.05 ；與BMNC組相比,bP＜0.05；與BMSC組相比,cP＜0.05；與4 d對應組相比,dP＜0.05

表1 治療后4、28 d各組大鼠神經功能評分( x-±s, 分)

3 討論

3.1 骨髓源干細胞移植治療腦血管病的作用機制 干細胞對腦梗死治療的作用機制是干細胞研究重要環節。實驗表明BMSCs治療腦梗死的作用機制眾多, 目前尚未達成共識。一般認為其治療效果的發揮是多途徑的, 且隨移植時間、空間和途徑的不同而變化。如腦梗死急性期移植主要通過神經營養保護、抗炎和免疫抑制作用而發揮其療效, 而慢性期移植則通過血管和神經組織重建而起作用。

3.2 細胞移植途徑 蛛網膜下腔通過腦脊液與腦室、循環系統相連。經蛛網膜下腔移植, 可將細胞直接送入腦脊液內,到達病變部位。沒有血腦屏障的阻礙, 移植的細胞能最大限度發揮作用。較腦立體定位注射、介入移植的風險低, 存活率高。但大鼠試驗移植難度較大, 為防大鼠因顱內壓增高死亡, 應準確掌握進針角度、速度, 移植的劑量等。

3.3 中藥復方聯合骨髓干細胞移植對MCAO大鼠神經功能修復的影響 缺血性腦梗死屬中醫“中風”范疇, 以氣虛血瘀、風火夾痰、濁夾瘀、痹阻脈絡為主要病機。中藥復方蝮龍抗栓丸以“益氣活血、熄風化痰、化瘀通絡”為治法, 對缺血性中風發揮作用［2］。

中藥對BMSC的影響為促進BMSCs的生長、增殖、分化等多個環節。近年來漸有中醫藥在BMSC移植治療腦缺血損傷影響方面的報道, 但多集中于對其體外誘導分化, 藥物以單味中藥或提取物為主, 而中藥復方的研究少見。中藥對移植后微環境的調控對MSCS存活、遷移、分化［3］, 及神經組織恢復有重要意義。

以相同劑量移植, BMNC對神經功能的修復作用較好；BMNC與中藥聯合治療缺血性腦梗死大鼠的神經功能恢復情況最好, 中藥對神經功能恢復具有協同作用。

［1］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke, 1989, 20(1):84-91.

［2］ 池明宇.血栓病中醫藥治驗.沈陽：沈陽出版社, 1998:17-26.

［3］ 杜少輝, 陳東風, 李伊為, 等.龜板對腦缺血大鼠骨髓間充質干細胞移植后轉分化為神經元的影響.中華醫學雜志, 2005, 85(3): 205-207.

2014-08-13］

110101 沈陽市第二中醫醫院