L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化

蒙滋滋 鐘國強 涂榮會 何 艷 黎慶捷 李 爍

L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化

蒙滋滋 鐘國強 涂榮會 何 艷 黎慶捷 李 爍

目的 研究L型鈣通道β2亞基在心房顫動中的表達變化。方法 收集42例行風濕性心臟病瓣膜置換術患者右心房組織作為標本, 其中慢性心房顫動患者22例, 竇性心律患者20例, 分別作為慢性心房顫動組和竇性心律組。應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測L型鈣通道β2亞基的mRNA表達, 以及用Western Blot方法檢測L型鈣通道β2亞基的蛋白表達。結果 與竇性心律組比較, 慢性心房顫動組中L型鈣通道β2亞基在mRNA及蛋白水平的表達則均較竇性心律組顯著上調(P＜0.05)。結論 慢性心房顫動組心房組織中L型鈣通道β2亞基的表達上調, 從而影響心房顫動的發生和維持。

L型鈣通道β2亞基；心房顫動；右心房組織

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一, 目前房顫的作用機制尚不清楚。因此, 積極尋找新的靶點對臨床房顫的防治十分重要。L型鈣通道β2亞基(CACNB2)在人心肌中表達［1］, 并對房顫的發生有著密切聯系［2］, 但是目前關于CACNB2的研究較少, 本文就CACNB2在心房顫動中的mRNA及蛋白水平的表達進行研究, 探討其表達變化在房顫中的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇于2012年8月~2013年5月在廣西醫科大學第一附屬醫院心胸外科住院行風濕性心臟病瓣膜置換術的患者42例, 其中房顫患者22例(房顫病史>6個月), 竇性心律(竇律)患者20例, 分別作為慢性房顫(CAF)組和正常竇律(NSR)組。所選病例年齡、性別、手術方式并無統計學差異。病例選擇排除標準：①口服鈣離子拮抗劑患者；②有感染性心內膜炎；③臨床上有風濕性活動征象；④年齡>55歲或<18歲。⑤患有糖尿病, 嚴重肝腎疾病、系統性紅斑狼瘡等疾病。

1.2 標本采集和保存 所選病例于體外循環建立時取約100 mg右心房組織放入無RNA酶的凍存管中并迅速置于液氮中保存。

1.3 主要試劑 Trizol(invitrogen), 逆轉錄試劑盒(Fermantas#k 1622), 一抗(Santa Cruz, sc-81890), 二抗(北京中彬金橋, ZB-2305), 內參抗體(上海康成生物公司, KC-5G5)。

1.4 實驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測 ①取約50 mg右心房組織加入Trizol試劑中勻漿提取總RNA, 并將提取好的RNA溶解于DEPC水中, 于紫外分光光度儀測定濃度和OD值, 所有樣本總RNA的OD值均在1.8~2.0范圍內。將總RNA按Fermantas逆轉錄試劑盒#k1622說明書進行逆轉錄合成cDNA。②引物由上海生工生物有限公司代為設計合成CACNB2 Forward primer:5'-ATGCGAGCAGGACGTCGA-3',CACNB2 Reverse primer:5'-TTAGAGCGGCTCCACTTGG-3';β-actin Forward primer:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3';β-actin Reverse primer:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。③qRT-PCR檢測：使用SYBR Green 1染料法進行相對定量。qRT-PCR使用儀器為美國AB7500實時熒光定量PCR儀。CACNB2及β-actin反應條件：95°變性10 min, 95°變性15 s, 58°退火45 s, 72°延伸30 s, 共40個循環, 72°延伸10 min。④根據目的和內參所得的Ct值, 用內參做標準化處理, 計算2-△△ct值以進行相對定量, 計算所得值用相對于竇律組表達的倍數來表示。

1.4.2 Western Blot檢測 ①取約50 mg右心房組織放入RIPA裂解液中, 并加入蛋白酶抑制劑后進行勻漿。提取總蛋白后, 用BCA試劑盒測定蛋白濃度。②取等量蛋白上樣進行電泳(10%分離膠, 5%濃縮膠), 用0.45 mmPVDF膜進行轉膜, 5%TBST牛奶封閉, 目的一抗及內參GAPDH孵育過夜, 二抗孵育1 h。③為了校正上樣量及曝光時間造成的差異,顯影時采用GAPDH作為內參, 每個條帶均同時檢測GAPDH的表達量。各條帶CACNB2的相對表達量為CACNB2灰度值/GAPDH的灰度值。

2 結果

2.1 CACNB2的qRT-PCR結果 組間CACNB2的比較,慢性房顫組較正常竇律組明顯上調［(1.9783±0.3231)VS (0.7215±0.4021), P＜0.05］, 差異有統計學意義。

2.2 CACNB2的Western Blot結果 經過軟件獲取條帶的灰度值, 計算目的條帶與內參條帶GAPDH的灰度值之比, 進行相對半定量分析, CACNB2在房顫組中蛋白表達顯著高于正常竇律組［(1.35±0.20)VS(1.07±0.23), P＜0.05］。結果如圖1所示, 差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖1 心房顫動 (RAF) 組與竇性心律 (RSR) 組蛋白表達的對比

3 討論

心房顫動是常見的心律失常之一, 目前發病機制尚未清楚。近年研究表明, 心房顫動與心房肌的有效不應期縮短有關［3］, 主要為動作電位2期平臺期的縮短, 而此期ICaL作為與鉀離子通道電流拮抗的電流［4］, 在心房顫動中起重要作用。風濕性因素對于L型鈣通道的表達無直接影響 。Yue等在房顫犬模型的研究中提出IcaL降低［5］, 此后亦有不少文獻作相關報道。對慢性房顫的研究中, 目前鈣超載是房顫的發生和維持的主要機制之一, 是電重構的重要環節［6］。L型鈣通道在鈣電流變化中起重要作用。L型鈣通道β亞基有四種亞型, 只有β2亞基在心肌表達［1］。本研究通過RT-PCR和Western Blot可知, 房顫組mRNA及蛋白表達高于竇律組,即CACNB2表達發生了上調, 此結果與Schotten的報道相似。Schotten等［7］研究發現持續性房顫患者心肌L型鈣通道β2a亞基的表達并不下調, 所以, 房顫時IcaL降低可能與其他亞基或者亞型的下調或表達異常有關。本實驗研究的是慢性房顫患者右心耳組織中L型鈣通道β2亞基的表達, 而在既往的研究中鮮有相關報道。

CACNB2表達發生上調, 可使L型鈣通道活性增強, 加速L型鈣通道激活, 增加鈣電流,促使細胞內Ca2+濃度迅速增高, 發生了鈣超載, 導致L型鈣通道本身加速失活, IcaL降低, 有效不應期縮短, 促進房顫的發生［8］。而L型鈣通道的失活不僅與膜電位有關, 還與細胞內鈣濃度相關［9］, 房顫時快速心房率會進一步加劇細胞內鈣超載, 引起細胞內L型鈣通道其他亞基和其他鈣通道的表達和功能的改變, 進而維持房顫的發生［5］。

［1］ Bodi I, Mikala G, Koch SE, et al.The L-type calcium channel in the heart：the beat goes on.Clin InVest, 2005(115):3306-3317.

［2］ Antzelevitch C, Pollevick GD, Cordeiro JM,et al.Loss-of-function mutations in the cardiac calcium channel underlie a new clinical entity characterized by ST-segment elevation, short QT intervals, and sudden cardiac death.Circulation, 2007,115(4):442-449.

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［4］ Van Wagoner DR, Pond AL, Lamorgese M, et al.Atrial L-type Ca2+ currents and human atrial fibrillation.Circ Res, 1999,85(5):428-436.

［5］ Shi YQ, Yang C, Ding WJ, et al.Changes of the mRNA and protein expression of α1 subunit of L-type and T-type calcium channels in human atrial myocardlum of rheumatic atrial fibrillation patients.Molecular Cardiology of China, 2011,10(1):11-16.

［6］ Allessie M, Ausma J, Schotten U.Electrical, contractile and structural remodeling during atrial fibrillation.Cardiovasc Res, 2002, 54(2):230-246.

［7］ Schotten U, Haase H, Frechen D, et al.The L-type Ca2+ channel subunits alphalC and beta2 are not downregulated in atrial myocardium of patients with chronic atrial fibrillation.Jmol Cardiol, 2003, 35(5):437-443.

［8］ Findlay I.Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels: one switch.J Physiol, 2004,554(2):275-283.

［9］ De Leon M,Wang Y, Jones L, et al.Essential Ca(2+)-binding motif for Ca(2+)-sensitive inactivation of L-type Ca2+ channels.Sciense, 1995, 270(5241):1502-1506.

Changes of the expression of L-type calcium channel β2subunit in human atrial myocardium of atrial fibrillation patient.

MENG Zizi, ZHONG Guoqiang, TU Ronghui, et al.Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical, University, Nanning 530021, China

Objective To investigate Changes of the expression of L-type calcium channel β2subunit(CACNB2) in atrial fibrillation (AF).Methods The right atrial tissue was collected from Rheumatic heart valve replacement patients, and the number of the patient were 22 for Chronic AF, 20 for normal Sinus rhythm(NSR).Respectively, Real-time quantative PCR(qRT-PCR)was used to examine the expression of mRNA of CACNB2, and Western Blot was used to examine the expression of protein of CACNB2.Results Compared with NSR group, the expression of mRNA and protein of CACNB2 were significantly up-regulated (P＜0.05) in AF group.Conclusion The occurrence of AF may associate with changes of theexpression of CACNB2 which plays an important role in atrial fibrillation.

L-type calcium channelβ2subunit; Atrial fibrillation; Right atrial tissue

廣西自然科學基金項目(項目編號：桂財教201319 號)

530021 南寧, 廣西醫科大學第一附屬醫院老年心內科

鐘國強 E-mail：gq_zhong@yahoo.com