維生素D受體基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關(guān)系

劉靜波 侯燕燕 齊曦明 唐利娟 周文文 彭勇 楊雁鴻

·論著·

維生素D受體基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關(guān)系

劉靜波 侯燕燕 齊曦明 唐利娟 周文文 彭勇 楊雁鴻

目的探討維生素D受體(VDR)等位基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關(guān)系。方法172例河北漢族肺腺癌患者和180例健康對(duì)照。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性的方法對(duì)VDR的Bsm1、Fok1等位基因多態(tài)性與肺腺癌的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果肺腺癌組VDR基因Bsm1位點(diǎn)基因型分布、等位基因分布Fok1位點(diǎn)基因型分布與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位點(diǎn)基因型分布，其等位基因分布與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論VDR基因Bsm1位點(diǎn)多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。Bsm1位點(diǎn)B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。VDR基因Fok1位點(diǎn)多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能關(guān)聯(lián)。

多態(tài)性;維生素D;肺腫瘤;易感性

肺癌作為臨床最為常見的惡性腫瘤，其病死約占所有癌癥死亡的17.8%，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，我國目前每年新發(fā)數(shù)約有50萬，呈逐年遞增趨勢(shì)[1]。其中75%～85%的肺癌發(fā)病中為非小細(xì)胞肺癌，2/3確診時(shí)已屬晚期[2]。而肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中最常見、預(yù)后最差的類型之一，據(jù)研究資料表明，肺腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，在很多國家超過了鱗癌成為最常見的肺癌組織學(xué)類型。VDR是核受體超家族的成員，已有大量研究表明，VDR基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有明顯的相關(guān)性[3]。本實(shí)驗(yàn)擬研究VDR基因多態(tài)性與肺腺癌易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年10月至2013年3月，秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科住院的晚期腺癌患者(均為ⅢB期/Ⅳ期)172例，所有病例均有病理學(xué)診斷依據(jù)，除外其他癌癥患者及合并糖尿病、心血管疾病等。對(duì)照組為同期隨機(jī)在秦皇島市第一醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康體檢者180例。病例組及健康對(duì)照組均來自秦皇島市及周邊的中國漢族人。肺腺癌組中，男82例，女90例；平均年齡(64±11)歲。對(duì)照組中，男85例，女95例；平均年齡(63±11)歲。2組一般資料有均衡性。

1.2 方法 采用外周血DNA提取試劑盒提取DNA，Marker ⅠDNA 及l(fā)adder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶和其緩沖液及4dNTPs購自Promega，Bsm1及Fok1限制性內(nèi)切酶購自Biolabs。引物的序列由基因庫公布的VDR基因序列合成，并采用DNAman的程序設(shè)計(jì)，合成公司為北京鼎國昌盛生物公司。最后根據(jù)酶切結(jié)果挑選各個(gè)位點(diǎn)不同基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司完成，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段并且確定基因型。先采集外周靜脈全血2 ml，然后用外周血DNA分離試劑盒來提取DNA。Bsml位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系的總量為25 μl，F(xiàn)ok1位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系的總量為25 μl，其中有基因組DNA、TaqDNA聚合酶和引物TaqDNA聚合酶緩沖液。Bsml上游的引物(5’-3’)為GGCAACCTGAAGGGAGACGTA，下游的引物(5’-3’)為CTCTTTGGACCTCATCACCGAC。通過編好程序的PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)參數(shù)如下：Bsml位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸40 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)為72℃延伸5 min。Fok1上游的引物(5’-3’)為CTCCGAAGGCACTGTGCTCAGGCCT,下游的引物(5’-3’)為ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC。其反應(yīng)參數(shù)如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計(jì)30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)為72℃延伸10 min。Bsml位點(diǎn)及Fok1位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物分別加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶5 μl和緩沖液，Bsm1位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)物在65℃恒溫箱16 h，然后對(duì)酶切產(chǎn)物電泳。Fok1位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)物在37℃恒溫箱16 h，然后對(duì)酶切產(chǎn)物電泳。

1.3 結(jié)果判斷 VDR基因的第8內(nèi)含子rs1544410位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)應(yīng)Bsml限制性酶切位點(diǎn)位點(diǎn)為堿基A→G突變。65℃恒溫箱16 h，A等位基因純合子表現(xiàn)為461 bp一個(gè)條帶，命名為BB基因型；G等位基因純合子表現(xiàn)為258 bp和 203 bp兩個(gè)條帶，命名為bb基因型；雜合子狀顯示為 461 bp， 258 bp，和203 bp3個(gè)條帶，命名為Bb基因型。VDR基因的第2外顯子rs10735810位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)應(yīng)Fok1限制性酶切位點(diǎn)，為堿基T→C的突變。T等位基因純合子表現(xiàn)為265 bp一個(gè)條帶，命名為FF基因型；C等位基因純合子顯示為207 bp和60 bp2個(gè)條帶，命名為ff基因型；雜合子顯示為 265 bp，207 bp和60 bp3個(gè)條帶，命名為Ff基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件，病例組與對(duì)照組組間VDR基因型分布概率的比較采用χ2檢驗(yàn)，關(guān)于肺腺癌的危險(xiǎn)的因素，選擇應(yīng)用非條件Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bsm1及Fok1酶切后的電泳結(jié)果 Bsm1位點(diǎn)各基因型的條帶數(shù)目和位置見圖1，F(xiàn)ok1位點(diǎn)各基因型的條帶數(shù)目和位置，見圖2。

2.2 VDR Bsm1位點(diǎn)及 Fok1位點(diǎn)基因型分布 病例組VDR基因Bsm1位點(diǎn)基因型分布、等位基因分布Fok1位點(diǎn)基因型分布與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位點(diǎn)基因型分布，其等位基因分布與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討論

VDR是介導(dǎo)1,25(OH)2D3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，為甲狀腺激素、類固醇激素受體超家族成員。維生素D在正常組織內(nèi)有促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞生長的作用[4]，這種功能受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子VDR 的調(diào)節(jié)。1,25(OH)2D3即活性維生素D在體內(nèi)具有多方面的活性，可維持鈣、磷平衡和骨代謝。此外，1,25(OH)2D3在腫瘤的預(yù)防和治療方面也起著重要作用[5-7]。許多體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了1,25(OH)2D3對(duì)肺癌的抑制作用[8]。VDR基因多態(tài)性的相關(guān)性研究主要集中在骨質(zhì)疏松、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腫瘤、佝僂病及尿石癥等疾病方面。核受體狀況可能成為NSCLC的預(yù)后指標(biāo)。評(píng)估VDR基因多態(tài)性對(duì)VDR表達(dá)的影響，需要針對(duì)維生素D信號(hào)通路可能是通過在目標(biāo)肺癌組織中VDR的身份影響治療[9]。目前檢測(cè)的VDR基因多態(tài)性酶切的位點(diǎn)分別為Cdx-2、Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。

圖1 VDR-PCR產(chǎn)物經(jīng)Bsm1酶切后的電泳圖

圖2 VDR-PCR產(chǎn)物經(jīng)Fok1酶切后的電泳圖

表1 2組人群VDR的Bsm1及Fok 1基因多態(tài)性分布 例

本研究應(yīng)用Bsm1和Fok1限制性內(nèi)切酶對(duì)河北秦皇島籍漢族172例晚期肺腺癌及180例健康成人的VDR基因多態(tài)性進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組VDR基因Bsm1位點(diǎn)多態(tài)性與晚期肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。Bsm1位點(diǎn)B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。VDR基因Fok1位點(diǎn)多態(tài)性與晚期肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能關(guān)聯(lián)。這一結(jié)果與Dogan等[10]的研究結(jié)果不一致，Dogan發(fā)現(xiàn)降低VDR活性的Taq1多態(tài)性基因可能是患肺癌的危險(xiǎn)因素，而性別、年齡、吸煙可能加重這一因素的影響。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性與早期肺腺癌患者生存率之間無明顯關(guān)聯(lián)，VDR基因多態(tài)性可能與早期NSCLC的鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率提高有關(guān)。VDR與肺癌相關(guān)性的研究目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。近年國內(nèi)外有大量關(guān)于VDR基因的研究報(bào)道，顯示VDR基因位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布因人種不同而差異較大[1-5]。如Bsm1位點(diǎn)，我國人群中等位基因B頻率約為10%，略低于日本人(15%～20%)，與韓國人相近(約11%)。而在高加索人群中，等位基因B頻率可達(dá)35%以上。就基因型比例，我國人群中bb型較多，達(dá)90%以上，Bb型次之，而BB型低于2%。而在高加索人群中，則以Bb型居多，約45%～55%，BB型為18%以上。本研究結(jié)果與部分文獻(xiàn)報(bào)道出現(xiàn)的結(jié)果不同，其原因可能為秦皇島坐落于中國河北省的東北部，其季風(fēng)氣候?yàn)榕瘻貛О霛駶櫞箨懶裕部赡芘c研究對(duì)象的種族差別、環(huán)境暴露因素、接觸致癌因素的迥同及未省的混同因素有關(guān)[12-15]。需要在其他不同人群中反復(fù)實(shí)驗(yàn)以及進(jìn)一步擴(kuò)增樣本量繼續(xù)進(jìn)行研究，來進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 朱洪源，陳成．晚期非小細(xì)胞肺癌的藥物治療進(jìn)展．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21：4154-4157．

2 韓曉，王哲海．非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)亞型與藥物療效關(guān)系．腫瘤防治研究，2010，37：1084-1087．

3 Shields PG．Molecular epidemiology of smoking and lung cancer．Oncogene，2002，2 1：6870-6876.

4 Nagpal S，Na S，Rathnachalam R．Noncalcemic actions of vitamin D receptor ligands．Endocr Rev，2005，26：662-687.

5 Bouillon R,Eelen G,Verlinden L,et al.Vitamin D and cancer.Steroid Biochem Mol Biol,2006,102:156-162.

6 Krishnan AV,Trump DL,Johnson CS,et al.The role of vitamin D in cancer prevention and treatment.Endocrinol Metab Clin North Am,2010,39:401-418.

7 Davis CD,Milner JA.Nutrigenomics,Vitamin D and cancer prevention.J Nutrigenet Nutrigenomics，2011,4:1-11.

8 陳佳琦,張力.維生素D對(duì)肺癌的抑制作用.國際呼吸雜志,2010,30:1375-1379.

9 Srinivasan M,Parwani AV,Hershberger PA,et al.Nuclear Vitamin D Receptor Expression is Associated with Improved Survival in Non-Small Cell Lung Cancer.Steroid Biochem Mol Biol,2011,123:30-36.

10 Dogan I,Onen HI,Yurdakul AS,et al.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and risk of lung cancer.Med Sci Monit,2009,15:BR232-BR242.

11 Zhou W,Heist RS,Liu G,et al.Polymorphisms of Vitamin D receptor and survival in early-stage non-small cell lung cancer patients.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15:2239-2245.

12 李榕，樓煜清，顏波，等.維生素D受體基因多態(tài)性位點(diǎn)rs7975232與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性.中國醫(yī)藥，2013，8：1390-1392.

13 楊雁鴻，周文文，唐利娟，等.維生素D受體基因多態(tài)性與吸煙因素交互作用對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的影響.中國老年學(xué)雜志，2013，33：3844-3846.

14 蔣普，蔣過億.1，25二羥基維生素D3對(duì)肺癌抑制作用.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10：998-1000.

15 康曉征，陳克能.維生素D對(duì)肺癌的抑癌機(jī)制.國際腫瘤學(xué)雜志，2012，39：594-597.

RelationshipbetweengenepolymorphismsofvitaminDreceptorandsusceptibilityoflungadenocarcinoma

LIUJingbo*,HOUYanyan,QIXiming*,etal.*TheFirstHospitalofQinhuangdaoCity,Hebei,Qinhuangdao066000,China

ObjectiveTo explore the correlation between gene polymorphisms of vitamin D receptor (VDR) and susceptibility of lung adenocarcinoma.MethodsThe 172 patients with lung adenocarcinoma (lung adenocarcinoma group) and 180 healthy subjects (control group) were enrolled in the study,and all the subjects were Chinese Han people in Hebei province. The correlation between allele polymorphism of Bsm1,Fok1 site of VDR and lung adenocarcinoma was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThere were significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (χ2=8.111 and 6.492,P<0.05). However there were no significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (P>0.05).ConclusionBsm1 gene site polymorphism of VDR gene is closely correlated to pathogenesis risk of advanced lung adenocarcinoma. Bsm1 B allele may increase the pathogenesis risk of lung cancer.Fok1 site polymorphism of VDR may be related with pathogenesis risk of lung cancer.

polymorphisms; vitamin D;lung neoplasms; susceptibility

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.007

066000 河北省秦皇島市第一醫(yī)院(劉靜波、齊曦明、唐利娟、楊雁鴻)；承德醫(yī)學(xué)院(侯燕燕、周文文)；燕山大學(xué)(彭勇)

楊雁鴻，066000 河北省秦皇島市第一醫(yī)院；

E-mail：yyh_0615@163.com

R 734.2

A

1002-7386(2014)12-1780-03

2013-12-16)