真核表達載體PEGFP-N1-IL-2的構建

劉秋霞 馮軍 趙志國 劉冰慧 龔志平

白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由T輔助細胞產生的細胞因子，具有廣泛的生物學活性，在免疫應答的調節過程中起著重要作用。本實驗的目的就是克隆IL-2基因為下一步IL-2cDNA導入其他細胞為其臨床應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6小鼠、大腸桿菌DH5α、質粒 PEGFP-N1載體、SuperscriptTMIII/RNaseOutTM Enzyme Mix(Invitrogen公司)、Pfu DNA聚合酶(北京天為時代科技有限公司)、T4 DNA 連接酶、BamH I、KpnI、BglII(Takara公司)、RNA提取試劑盒、RT試劑盒、PCR試劑盒(Invitrogen公司)、DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA提取與純化試劑盒(Promega公司)、標準分子量DNA、PCR Markers(北京天為時代科技有限公司)

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取:頸脫位處死C57BL/6小鼠，無菌摘除脾臟，使用RNA提取試劑盒提取RNA并進行完整性及純度測定。

1.2.2 RT-PCR:按照Genebank提供的序列，由上海生工生物工程有限公司設計合成引物。分別為:β-actin:上游5’＞CCCCAAGGCCAACCGTGAA ＜3’下游5’＞CGGAATCGCTCGTTGCCAATGT＜3’擴增產物為 435 bp。IL-2:1:5’-CCTTGCTAATCACTCCTCAC 2:5’-TATGTGTTGTAAGCAGGAGG擴增產物為510 bp。參照RT試劑盒、PCR試劑盒(Invitrogen公司)試劑盒說明，得到PCR產物，經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如見到預期510 bp大小的 DNA條帶，則表明 IL-2cDNA擴增成功。

1.2.3 PCR產物回收與純化:取PCR后產物按照DNA凝膠回收試劑盒(Promega公司)進行回收與純化。

1.2.4 真核表達載體PEGFP-N1-IL-2的構建:分別取用限制性內切酶BamHI和KpnI雙酶切后的PCR產物和用限制性內切酶BamHI、限制性內切酶KpnI雙酶切后質粒PEGFP-N1大片段，加入T4DNA連接酶作定向連接，將連接體轉化至感受態細胞并轉移到含有卡那霉素的LB固體培養基上，涂布均勻，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，于37℃培養16 h待菌落長出。挑取一個長出的菌落加入含有卡那霉素的LB液體培養基的試管中，放入37℃搖床中250 r/min搖菌過夜培養12 h后用質粒提取試劑盒按照其操作說明提取質粒。取部分提取的質粒為模板，以PCR引物Primer1、Primer2進行PCR擴增，其PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳帶，鑒定融合質粒PEGFP-N1-IL-2構建是否成功。

1.2.5 序列分析:取上述經PCR鑒定的菌液送測序公司進行基因序列測定。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠脾組織總RNA的提取 以C57BL/6小鼠脾組織為原材料提取總RNA，紫外分光光度計測定表明OD260/OD280=1.845，1%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示28S.18S.5S三條明顯條帶，且28S＞18S，說明提取的總RNA完整且純度符合反轉錄要求。見圖1。

2.2 RT-PCR 用所提取的總RNA和Primer1.Primer2.進行RT-PCR，同時以β-actin作為內參照，其產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示一條510 bp預期長度的條帶，與目的基因長度一致。說明IL-2 mRNA提取成功，逆轉錄合成的cDNA完整，初步證明目的基因克隆成功。見圖2。

2.3 擴增片段的基因克隆 將RT-PCR純化產物與質粒PEGFP-N1分別用限制性內切酶BamH I和Kpn I雙酶切后，加入T4DNA連接酶作定向連接，構建重組質粒PEGFP-N1-IL-2。經1%的瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質粒PEGFP-N1-IL-2構建成功。見圖3。

圖1 總RNA

圖2 RT-RCR顯示510 bp預期長度條帶

圖3 擴增片段的基因克隆

2.4 克隆片段的DNA序列分析 將重組質粒PEGFP-N1-IL-2送測序公司進行測序，結果與Genebank中小鼠IL-2cDNA(K02292)序列完全一致。見圖4。

圖4 IL-2cDNA序列

3 討論

細胞因子是由機體活化的免疫細胞及某些基質細胞分泌的小分子蛋白質，通過結合細胞表面的相應受體發揮生物學效應。其主要的生物學功能是介導和調節免疫應答和炎性反應。IL-2是其中一種，1976年Morgan等發現小鼠脾細胞培養上清中含有一種刺激胸腺細胞生長的因子，由于這種因子能促進和維持T細胞長期培養，稱為T細胞生長因子(T cell growth factor，TCGF)，1979 年統一命名為 IL-2。IL-2 分子量為15.5 ku的蛋白質分子，由133個氨基酸殘基組成，有多重生物學功能，主要是促進T細胞生長、增殖及分化［1］;調節NK 細胞并保持它的自然殺傷力［2］;誘導細胞毒性T細胞的增殖和產生;促進B淋巴細胞的增殖作用;與其他細胞因子的協同作用［3］;可激活產生淋巴因子的殺傷(LAK)細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，刺激B細胞增殖分化和分泌抗體，并可誘導T細胞分泌 IFN-γ、TNF、CSF 等細胞因子等［4］，多重免疫學功能使其在多領域被廣泛研究并在臨床應用方面發揮著重要的作用，尤其對腎細胞癌、黑色素瘤、白血病、肺癌、癌性胸腹水等的治療、抗感染、自身免疫性疾病等方面都有一定的應用。IL-2的血漿半衰期僅約為2 h，臨床上為維持其療效常須大劑量頻繁注射，這不僅導致其毒性增加，還提高了治療成本。它的毒副作用主要會出現感冒樣癥狀如寒戰、頭痛，胃腸道反應惡心、嘔吐、等，毛細血管滲漏綜合征(CLS)如少尿、水腫、低血壓等，神經系統癥狀如焦慮、幻覺、昏迷等，感染，貧血等。為了克服IL-2半衰期短和病灶局部量不足的這些缺點，比如利用轉基因表達IL-2治療惡性腫瘤的基礎研究中，將攜帶IL-2基因的真核表達載體直接導入病灶，有可能發展成為腫瘤治療的有效方法［5］。所以我們構建了真核表達載體PEGFP-N1-IL-2，為其下一步轉染到真核或原核細胞持續分泌IL-2更有效的應用于臨床作準備。目前，對于IL-2的研究日益加深，對于其在臨床治療上起到了不可忽視的作用，但在某些方面還存在一些分歧，有待進一步研究。

1 Lan RY，Selmi C，Gershwin ME.The regulatory，inflammatory，and T cell programming roles of interleukin-2(IL-2).Autoimmun，2008，31:7-12.

2 Gruenbacher G，Gander H，Nussbaumer O，et al.IL-2 costimulation enables statin mediated activation of human NK cells，preferentially through a mechanism involving CD56+dendritic cells.Cancer Res，2010，70:9611-9620.

3 Yang H，Cheng EY，Sharma VK，et al.Dendritic cells with TGF-1 and IL-2 differentiate naive CD4+T cells into alloantigen specific and allograft protective Foxp3+regulatory T cells.Transplantation，2012，93:580-588.

4 Vella AT，Dow S，Potter TA，et al.Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:3810-3815.

5 金曉凌，井清源，王炳生，等.瘤體內直接注射白介素-2質粒復合物治療小鼠肝癌.中國腫瘤臨床，2001，28:779-782.