異丙酚對大鼠腦損傷后神經細胞凋亡及腦組織Caspase-3表達的影響

孫正清 蘇芳 蓋成林 楊天德

·論著·

異丙酚對大鼠腦損傷后神經細胞凋亡及腦組織Caspase-3表達的影響

孫正清 蘇芳 蓋成林 楊天德

目的探討異丙酚對大鼠腦損傷后神經細胞凋亡及腦組織Caspase 3蛋白表達的影響，為異丙酚的臨床應用提供更為重要的科學依據。方法24只雄性Wistar 大鼠隨機分為假手術組、冷凍傷后0.9%氯化鈉溶液組和異丙酚組。異丙酚給藥量為臨床麻醉相關劑量(100 mg/kg)：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量。采用顱骨外腦冷凍傷法，運用液氮冷凍器局部冷凍大鼠左側頂部腦組織60 s制作冷凍傷即腦損傷模型。3組傷后24 h采用TUNEL法檢測神經細胞凋亡,采用免疫組化法測定Caspase 3蛋白表達,并進行神經創傷評分。結果異丙酚組神經細胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液組比較降低(P<0.05)，但仍顯著高于假手術組(P<0.01)。腦冷凍傷后24 h，0.9%氯化鈉溶液組Caspase 3蛋白陽性表達水平較假手術組明顯升高(P<0.01)，異丙酚組腦組織Caspase 3蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低(P<0.05) 。腦冷凍傷后大鼠出現神經功能障礙，傷后24 h異丙酚治療組神經創傷評分(NSS)明顯低于0.9%氯化鈉溶液治療(P< 0.05)。結論臨床麻醉相關劑量的異丙酚可以減輕腦損傷后延遲性神經細胞凋亡、促進神經功能的恢復。

異丙酚；腦創傷；凋亡；Caspase 3

顱腦損傷是一種較為嚴重復雜的腦創傷，是導致創傷患者傷殘及死亡的重要原因。目前認為，腦損傷引起的急性期神經元死亡是以壞死為主，而繼發死亡或遲發性死亡則以凋亡為主，前者發生在缺血后早期的中心區，后者多發生在缺血后的半影區，大約50%的神經細胞死亡是凋亡[1]。異丙酚作為一種常用的臨床麻醉及重癥患者鎮靜用藥，隨著對其藥理特性的深入研究，其抗氧化及腦保護作用已逐漸被人們所認識。本研究采用腦冷凍傷這一經典的腦創傷模型，以異丙酚腹腔注射為干預，觀察異丙酚對大鼠腦損傷后神經細胞凋亡及腦組織Caspase 3蛋白表達的影響，為異丙酚的臨床應用提供更為重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性 Wistar 大鼠24只，體重230～250 g，由第三軍醫大學大坪野戰外研所提供。隨機分為假手術組：只切開頭皮而未行冷凍傷處理；冷凍傷后0.9%氯化鈉溶液組：冷凍傷后15 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 ml/kg,0.5 h后再次追加相同劑量；異丙酚組：冷凍傷后15 min腹腔注射異丙酚50 mg/kg，0.5 h后再次追加相同劑量。每組8只大鼠，3組傷后24 h進行神經創傷評分，之后處死動物，收集腦組織標本運用TUNEL技術進行凋亡檢測,采用免疫組化法測定Caspase 3蛋白表達。

1.2 動物模型制備 按照參照文獻[2]的方法制備動物模型。1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，待角膜及翻正反射消失后，俯臥位固定于立體定位儀上，碘氟消毒頭部皮膚，沿正中切開頭皮，分離骨膜，暴露左頂顱骨。將內盛丙酮的冷凍器直接浸泡入液氮中預冷，使冷凍器溫度為液氮溫度(-196℃)。將直徑5 mm冷凍頭垂直置于矢狀縫左旁開5.5 mm為圓心的骨面上(冷凍頭前緣至冠狀縫)，冷凍60 s，造成左頂葉腦皮層的冷凍傷。手術室溫度為25℃，術中電燈泡照射維持肛溫為37～37.5℃。術畢自由進食水。

1.3 TUNEL法腦組織凋亡檢測 冷凍傷后24 h,3組大鼠經1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉，剪開胸前臂，暴露心臟，經左室插入靜脈針頭直達主動脈，快速灌注肝素生理鹽水，剪開右心耳放血，待流出液體清亮后(約需0.9%氯化鈉溶液200 ml)，再以4%多聚甲醛溶液灌注45 min，約300 ml固定。迅即斷頭取腦，以凍傷灶為中心切取冠狀腦組織塊，4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h,移入30%蔗糖溶液置4℃脫水24 h至沉底。脫水后的標本于冰凍切片機預冷后做冠狀面切片，每個標本切片6張，切好的標本放于冰箱中冷藏備用。TUNEL法檢測程序，按照試劑盒(北京中山生物技術有限公司)使用說明書程序進行。TUNEL陽性細胞胞核中呈現棕黃色顆粒，陰性對照細胞核藍染。每只大鼠選取一張腦切片，在400倍光鏡下，隨機取傷灶周圍皮質10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，總計1 000個細胞，計算出平均陽性率，即得AI(apoptosis index)。計算公式為：凋亡指數(AI)=TUNEL陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.4 腦組織Caspase 3蛋白表達 取上述冷藏備用的冰凍切片,采用SABC法行Caspase 3蛋白免疫組織化學染色,選用北京中山生物技術有限公司生產的Caspase 3單克隆抗體，操作程序參照說明書進行．鏡下觀察胞漿有棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用醫學圖像分析軟件(Leica Qwin，德國)，進行分析。每組隨機選擇8張免疫組化染色片(免疫組化染色強度大致一致)，每張切片隨機選取6個高倍視野，用圖像分析軟件對染色結果進行灰度分析，以平均灰度值代表蛋白表達水平：蛋白表達強則灰度值低，反之則高。

1.5 神經創傷評分(Neurological severity score，NSS) 參照Shapira等[3]制定的評分標準，從運動、反射、行為、功能測試等項目進行評分。觀察在一個寬敞的房間中進行，觀察者為非實驗者，0分為最低分，表示未受損傷，25分為最高分，表示損傷最為嚴重。

2 結果

2.1 TUNEL法檢測細胞凋亡結果 顱腦冷凍傷后24 h，TUNEL陽性神經細胞表現為細胞呈圓形、皺縮，核固縮，整個細胞著色深，細胞核內有較強的TUNEL陽性染色，而細胞漿內TUNEL陽性染色較少，為凋亡神經細胞的特點。主要位于凍傷灶周圍。 假手術組腦組織及凍傷對側未見或只見極少量散在的凋亡細胞，這可能是正常的生理死亡。在腦冷凍傷后24 h，異丙酚組凍傷灶周圍神經細胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，但仍顯著高于假手術組(P< 0.01)。見表1、圖1～3。

2.2 Caspase 3蛋白表達結果 Caspase 3蛋白表達陽性細胞胞漿呈棕黃色染色。假手術組皮層Caspase 3染色陽性細胞較少。腦冷凍傷后24 h，0.9%氯化鈉溶液組Caspase 3蛋白陽性表達水平(蛋白表達強則灰度值低，反之則高)較假手術組明顯升高。陽性細胞表達主要來源于凍傷灶周圍缺血半暗帶區。異丙酚組腦組織Caspase 3蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05) 。見表1、圖4～6。

表1 冷凍傷后24 h神經細胞凋亡數及腦組織Caspase 3蛋白表達灰度值 n=8

注：與假手術組比較，*P<0.05,#P<0.01;與0.9%氯化鈉溶液組比較，△P<0.05

圖1 腦冷凍傷后24 h0.9%氯化鈉溶液組(TUNEL×400)圖2 腦冷凍傷后24 h異丙酚組(TUNEL×400)圖3 假手術組(TUNEL×400)

圖4 假手術組Caspase-3(免疫組化×400) 圖5 腦冷凍傷后24 h 0.9%氯化鈉溶液組Caspase-3(免疫組化×400) 圖6 腦冷凍傷后24 h異丙酚組Caspase-3(免疫組化×400)

2.3 神經創傷評分(NSS)結果 在冷凍傷后6 h 0.9%氯化鈉溶液組NSS為5.25±1.03，隨時間延長逐漸降低，傷后24 h異丙酚組明顯低于0.9%氯化鈉溶液組，差異有統計學意義(P<0.05)。假手術組NSS為0，表示無神經功能障礙。見表2。

表2神經創傷評分

組別凍傷后6h凍傷后24h假手術組0.00±0.000.00±0.000.9%氯化鈉溶液組5.25±1.033.00±0.76*異丙酚組—1.88±0.64#

注：與假手術組比較，*P<0.01;與0.9%氯化鈉溶液組比較，#P<0.05

3 討論

依據既往的報道,腦冷凍傷后皮質細胞凋亡于24 h達到高峰,并認為凋亡性細胞死亡促成了繼發性腦損傷，腦冷凍傷模型也是一個簡易的可用來研究創傷性腦損傷神經細胞凋亡的模型[4，5]。鑒于以上研究，本實驗應用TUNEL技術觀察腦冷凍傷后24 h的神經細胞凋亡情況。結果顯示假手術組腦組織存在極少量散在的凋亡細胞，這可能是正常的生理死亡。顱腦冷凍傷后24 h(0.9%氯化鈉溶液組)，皮質內神經細胞壞死主要位于凍傷灶中心區內，而表現為凋亡細胞特點的TUNEL陽性神經細胞主要位于凍傷灶周圍,呈散在分布。上述特點的出現可能與以下述因素有關：腦冷凍傷后凍傷灶中央區的神經細胞很快就會因為缺血缺氧而壞死。而周圍區是非直接遭受凍傷的部位，即所謂缺血半影區,缺血程度要輕于中央區，細胞處于相對靜息垂死狀態，離子傳遞受到抑制，能量合成減少，內環境改變較緩慢，細胞內鈣離子緩慢升高，再灌注時自由基等在此明顯堆積,內源性凋亡調節基因啟動，導致細胞凋亡。

同時，我們也觀察了異丙酚對腦冷凍傷后神經細胞延遲性凋亡的影響。研究結果顯示，在腦冷凍傷后24 h，異丙酚治療組凍傷灶周圍神經細胞凋亡與0.9%氯化鈉溶液治療組比較顯著降低，但仍顯著高于假手術組。說明異丙酚對腦冷凍傷后神經細胞延遲性死亡有保護作用。目前創傷性腦損傷時神經細胞凋亡的機制尚不完全清楚?，F有的資料表明，細胞凋亡相關調節蛋白如caspase家族在凋亡過程中起著必不可少的作用，特別caspase-3處于核心位置，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的關鍵因子[6],在本研究中，腦冷凍傷后24 h，生理鹽水組Caspase 3蛋白陽性表達水平較假手術組明顯升高，與既往研究結果[7]一致,異丙酚治療組腦組織Caspase 3蛋白表達水平與0.9%氯化鈉溶液組比較顯著降低，說明異丙酚可能通過降低腦組織Caspase 3蛋白表達來發揮抗凋亡作用。近年來，有關異丙酚對缺血性腦損傷神經細胞凋亡的影響已有所報道。研究顯示在腦缺血再灌注損傷異丙酚可以通過上調腦組織bcl-2表達、下調Caspase 3表達來發揮抗凋亡作用[8]。有關異丙酚對創傷性腦損傷的作用效應研究還較少。近期在創傷性腦損傷的離體模型的研究表明，異丙酚可劑量依賴性地減輕神經細胞的損傷,復合淺低溫效果更顯著[9]。國內王顯望等[10]研究顯示在自由落體腦創傷異丙酚可減輕神經細胞凋亡,支持本研究結果。我們的研究顯示異丙酚可減輕腦冷凍傷后神經細胞延遲性凋亡，推測可能與異丙酚抗氧化、調節Ca2+平衡、減輕興奮性氨基酸堆積進而影響凋亡調節蛋白如Caspase 3的表達有關。但確切的作用機制還需要進一步的研究。

中樞神經系統損傷時，行為學評分是對形態學評價藥物治療效果和神經功能恢復的重要補充。神經創傷評分(NSS)表明了鼠受傷后神經功能狀態。文獻報道，異丙酚可以改善缺血性腦損傷近期及遠期的神經功能的恢復[11]。魏興等[12]的研究發現，腦冷凍傷1 h NSS最高，之后漸下降，表明有部分神經功能自主恢復，麻醉藥氯胺酮可以明顯減輕傷后24 h NSS評分，促進了神經功能的恢復。本研究顯示，臨床麻醉劑量的異丙酚可明顯減輕傷后24 h NSS評分，表明異丙酚可促進腦冷凍傷后神經功能的恢復。

在本研究中，因實驗條件的限制，異丙酚以腹腔注射為干預，應用劑量為臨床麻醉相關劑量。至于異丙酚影響腦損傷后繼發損害的量效關系、治療的時間窗和具體的作用機制，需要采用更為先進的給藥方式，如微泵恒速給藥或靶控輸注技術，進一步深入探討。

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TheeffectofpropofolondelayedneuronalapoptosisandCaspase3expressionafterbraininjuryinrats

SUNZhengqing,SUFang,GAIChenglin,etal.DepartmentofAnesthesiology,No.230HospitalofPLA,Liaoning,Dandong118000,China

ObjectiveTo explore the effect of propofol on delayed neuronal apoptosis and Caspase 3 expression after brain injury in rats in order to provide important scientific basis for clinical application of propofol.MethodsTwenty-four health male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,physiological saline treatment group after brain injury,propofol treatment group after brain injury.Propofol was injected intraperitoneally in a dose of 100mg/kg which was equivalent to clinical dose for general anesthesia,in which 50mg/kg propofol was administered ip 15min after brain freezing injury,and another 50mg/kg propofol was injected at 30min after the first injection.The freezing -induced brain injury models in Wistar rats were established by freezer (pre-cold in liquid nitrogen with the temperature at -196℃)-induced brain injury in Wistar rats on the left parietal side of skull of rat for 1 min.Apoptosis of neural cells was detected by TUNEL,and the expression of Caspase 3 protein in brain of rats was detected by immunohistochemistry,moreover,neurological severity score (NSS) was evaluated 24 hours after brain injury.ResultsThere was a significant difference in nerve cell apoptosis between propofol treatment group and physiological saline treatment group (P<0.05),furthermore,the apoptosis cells in both groups were significantly more than those in sham-operation group (P<0.01).24 hours after brain freezing injury,the expression levels of Caspase 3 protein in physiological saline treatment group were significantly higher than those in sham-operation group (P<0.01),however,which in propofol treatment group were significantly lower than those in physiological saline treatment group (P<0.05).After brain freezing injury,nerve function disturbance occurred in rats,24 hours after brain injury,the NSS in propofol treatment group were significantly lower than that in physiological saline treatment group (P<0.05).ConclusionPropofol in clinical dose for general anesthesia can reduce delayed neuronal apoptosis,promote recovery of nerve function after brain injury.

propofol；brain injury；apoptosis；Caspase 3

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.006

118000 遼寧省丹東市，中國人民解放軍第230醫院麻醉科(孫正清、蘇芳、蓋成林)；第三軍醫大學附屬新橋醫院麻醉科(楊天德)

楊天德，400038 重慶市，第三軍醫大學附屬新橋醫院麻醉科；

E-mail:31011@sina.com

R 971.2

A

1002-7386(2014)12-1777-04

2013-12-27)