表沒食兒茶素沒食子酸酯對(duì)帕金森病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制探討

吳艷芬，劉漢杰，張延平，王 偉*（.河北省邯鄲市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 邯鄲 05600；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050000；.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 05600）

·論著·

表沒食兒茶素沒食子酸酯對(duì)帕金森病大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制探討

吳艷芬1，劉漢杰2，張延平3，王 偉3*
（1.河北省邯鄲市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 邯鄲 056001；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 石家莊 050000；3.河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056001）

目的觀察表沒食兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）對(duì)魚藤酮致帕金森（Parkinson disease,PD）大鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法健康成年雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組（每組20只）。實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組背部皮下注射魚藤酮制備PD大鼠模型，藥物干預(yù)組同時(shí)給予大鼠腹腔注射EGCG。采用分光光度法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)丙二醛（malondialdehyde,MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH），免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)大鼠中腦黑質(zhì)及紋狀體中酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表達(dá)變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中MDA明顯增高（P<0.05），GSH含量明顯降低（P<0.05），中腦TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯少于對(duì)照組（P<0.05）,TH蛋白在黑質(zhì)和紋狀體與對(duì)照組比較明顯降低（P<0.05）；EGCG干預(yù)后與實(shí)驗(yàn)組相比MDA明顯降低及GSH明顯增高（P<0.05）,TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯增加（P<0.05）,TH蛋白明顯增加（P<0.05）。結(jié)論化應(yīng)激在PD發(fā)病中起著非常重要的作用，抗氧化治療能有效減輕大鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元損傷情況，同時(shí)改善PD樣癥狀，為PD的治療提供了新的靶點(diǎn)。

帕金森病；表沒食兒茶素沒食子酸酯；多巴胺

帕金森病（Parkinsondisease，PD）是發(fā)生在中老年人群中較為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征性病理變化是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死及Lewy小體形成導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中多巴胺含量減少，臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力增高等[1]。最近的研究[2]結(jié)果顯示氧化應(yīng)激損害在PD黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元死亡過程中起著非常重要的作用。抗氧化治療PD已成為新療法中的重要研究方向。表沒食兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是從天然植物茶葉中分離提純出來的多酚類化合物復(fù)合體茶多酚的重要成分，EGCG具有良好抗氧化效應(yīng)，在許多神經(jīng)變性疾病中顯示出神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本研究觀察EGCG對(duì)魚藤酮制備PD動(dòng)物模型腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，為PD治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和動(dòng)物模型的制備：Witstar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量250～300g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組；對(duì)照組20只背部皮下注射葵花油1mL/kg，實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組各20只，按照2.0mg·kg-1·day-1背部皮下注射魚藤酮（魚藤酮溶解在葵花籽油中，充分振蕩混勻后4℃避光保存），其中藥物干預(yù)組在魚藤酮注射前半小時(shí)給予EGCG50mg·kg-1·day-1腹腔注射，共30d。飼養(yǎng)于晝夜交替的環(huán)境中，其間所有大鼠自由進(jìn)食水。

1.2 腦組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量測(cè)定：大鼠直接斷頭取腦，迅速分離紋狀體，液氮速凍，-80℃保存，用于測(cè)量MDA和GSH，具體實(shí)驗(yàn)方法按所購(gòu)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 免疫組織化學(xué)染色：大鼠深度麻醉下以4%多聚甲醛（4℃）經(jīng)心灌注固定,取腦固定4h,30%蔗糖液4℃過夜。所需部位冠狀位冷凍連續(xù)切片（厚40μm）,間斷集片,磷酸緩沖液洗片后行免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。相關(guān)切片分別以小鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase,TH）單克隆抗體（1∶3 000,Sigma）4℃孵育切片48h;生物素化羊抗小鼠IgG（1∶500）室溫孵育切片2h,1∶500HRP鏈霉卵白素室溫孵育1h。每步中間以Tris緩沖液洗片。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzine,DAB）呈色、貼片、封片、觀察。以正常羊血清代替一抗,作為陰性對(duì)照。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)：在光鏡40倍物鏡下,按James等方法,分別計(jì)數(shù)相關(guān)核團(tuán)1cm2面積TH（黑質(zhì)致密部）免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。

1.5Westernblot：大鼠快速斷頭取腦,置于冰板上選取黑質(zhì)及尾殼核所在腦塊,入液氮速凍后入低溫冰箱備用。取所需腦組織入4℃裂解液勻漿5min,冰浴靜置1h,4℃離心,取上清,Bradford法測(cè)定蛋白濃度。相關(guān)樣品取50μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e加入5%脫脂奶粉稀釋的小鼠TH單克隆抗體（1∶10 000）,4℃過夜。聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜以Tris緩沖液洗3次。羊抗小鼠IgG熒光抗體（1∶10 000，Rocland公司）室溫避光1h，漂洗5次，遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey公司）掃描并測(cè)定目標(biāo)蛋白單位光密度值，與β-actin（1∶5 000，SantaCruz）比值后，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況：與對(duì)照相比較,實(shí)驗(yàn)組大鼠有主動(dòng)活動(dòng)減少、動(dòng)作遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、不能直線行走、行走時(shí)多向一側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為表現(xiàn);毛色變黃變臟,體態(tài)呈弓背狀。藥物干預(yù)組大鼠的上述癥狀有明顯改善，向一側(cè)旋轉(zhuǎn)的癥狀明顯減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組明顯減少（P<0.05）;藥物干預(yù)組黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較實(shí)驗(yàn)組明顯增高（P<0.05），但較對(duì)照組仍有明顯減少（P<0.05）。見表1。

2.3Westernblot結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組大鼠TH蛋白在黑質(zhì)及尾殼核比對(duì)照組明顯減少（P<0.05）；藥物干預(yù)組TH蛋白在黑質(zhì)及尾殼核較實(shí)驗(yàn)組明顯增高（P<0.05）,但是較對(duì)照組仍有明顯減少（P<0.05）。見表1。

2.4 大鼠紋狀體中氧化應(yīng)激參數(shù)的改變:實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體中GSH的含量比對(duì)照組明顯減少（P<0.05）；藥物干預(yù)組GSH明顯增加（P<0.05）,但較對(duì)照組仍明顯減少（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量較對(duì)照組明顯增加（P<0.05）；藥物干預(yù)組MDA明顯減少（P<0.05）,但較對(duì)照組仍明顯增高（P<0.05）。見表1。

GroupsTHpositiveneuronsinSN（number）TH/β?actininSNTH/β?actininstriatumMDAinstriatum（nmol/mg）GSHinstriatum（mg/g）Control34．35±4．040．75±0．070．64±0．025．21±1．5543．73±4．58PD20．27±3．05?0．45±0．08?0．39±0．05?19．13±2．04?28．40±2．61?EGCG+PD25．97±3．02?#0．59±0．01?#0．51±0．03?#10．24±3．21?#35．42±3．21?#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vsPD group byqtest
PD：Parkinson disease；TH：tyrosine hydroxylase；SN：substantia nigra；MDH：malondialdehyde；GSH：glutathione

3 討 論

PD是最常見的神經(jīng)變性病之一，其病理改變主要是黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性受損。氧化應(yīng)激參與脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基過度蓄積，可能是引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的重要原因之一，從而促進(jìn)PD的病理過程,PD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷包括腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化增加、還原性谷胱甘肽耗竭及DNA損害等[4-6]，這些均提示氧化應(yīng)激在PD多巴胺能神經(jīng)元損傷過程中發(fā)揮著一定的作用，因此抗氧化治療是延緩疾病進(jìn)展的一條途徑。本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮處理后大鼠腦內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激，脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量明顯增高，同時(shí)自由基清除劑GSH含量明顯降低,表明紋狀體中氧化平衡被破壞，發(fā)生了氧化損傷。魚藤酮是一種源于某些植物根莖一直被視為安全的廣泛應(yīng)用于果蔬除害等方面的天然殺蟲劑。魚藤酮對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有明顯的神經(jīng)毒性作用[7]，接觸魚藤酮的大鼠可出現(xiàn)PD樣癥狀及帕金森病理性改變[8]。魚藤酮為制備PD動(dòng)物模型的有效藥物，本研究中也發(fā)現(xiàn)魚藤酮能導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激及多巴胺能神經(jīng)元損傷，同時(shí)也證明了氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病中起著非常重要的作用。這也為臨床上對(duì)PD患者抗氧化治療提供了理論依據(jù)。

EGCG是從綠茶中提取出來的多酚類化合物，其酚羥基是天然的供氫體，能夠提高內(nèi)源性抗氧化酶生成，在體內(nèi)外均具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化的功能[9]。最近研究[10]表明，EGCG具有多種藥理學(xué)作用，如較強(qiáng)清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗凋亡、抗病毒、預(yù)防癌癥和心臟病等。氧化應(yīng)激與PD病理機(jī)制密切相關(guān)，飲食來源可能成為預(yù)防和治療PD有效的抗氧化劑替代品。本研究結(jié)果顯示，魚藤酮背部皮下注射可以導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激及多巴胺能神經(jīng)元損傷而出現(xiàn)PD樣癥狀，給予大鼠EGCG，通過降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化狀態(tài)，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白酶的活性，增加總蛋白的合成能力，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，可改善大鼠PD樣癥狀，抗氧化治療可能是PD治療的新靶點(diǎn)。

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（本文編輯：趙麗潔）

MECHANISMOFEPIGALLOCATECHIN-3-GALLATENEUROPROTECTIONINPARKINSONDISEASERATSINDUCEDBYROTENONE

WUYanfen1,LIUHanjie2,ZHANGYanping3,WANGWei3*
（1.DepartmentofEndocrinology,theFirstHospitalofHandanCity,HebeiProvince,Handan056001,China；2.DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;3.DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofHandanCity,Handan056001,China）

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofepigallocatechin-3-gallate（EGCG）onthesubstantianigradopaminergicneuroninParkinsondisease（PD）ratsinducedbyrotenone.MethodsThehealthyadultmale60Wistarratswererandomlydistributedtothefollowinggroupscontrolgroup,PDgroupanddrugtherapygroup（n=20eachgroup）,PDanddrugtherapygroupswereinjectedsubcutaneouslyrotenoneinthebacktopreparethePDratsmodel,theratsofdrugtherapygroupwereinjectedintraperitoneallyEGCGatthesametime.Spectrophotometrywasusedtodetectoxidativestressparametersinrats（malondialdehydeandglutathione）,immunocytochemistryandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionoftyrosinehydroxylase（TH）inthesubstantianigraandstriatumofrats.ResultsMalondialdehyde（MDA）wassignificantlyhigher（P<0.05）,andglutathione（GSH）wassignificantlydecreased（P<0.05）intheratsstriatumofrotenonegroupthanthoseofcontrolgroup.ThenumberofTHpositiveneuronsinmidbrainwassignificantlylessthanthatofcontrolgroup（P<0.05），buttheexpressionofTHwassignificantlydecreasedinthesubstantianigraandstriatumcomparedwithcontrolgroup（P<0.05）;MDAobviouslydecreasedandGSHincreasedsignificantlyaftertheinterventionofEGCGcomparedwiththatofrotenonegroup（P<0.05）,thenumberofTHpositiveneuronssignificantlyincreased（P<0.05）andTHproteinincreasedsignificantly（P<0.05）.ConclusionOxidativestressplaysaveryimportantroleinthepathogenesisofPD,anti-oxidationtreatmentcaneffectivelyreducetheinjuryofdopaminergicneuronsinthebrainofrat,whichprovidesanewtargetforthetreatmentofPD.

Parkinsondisease;epigallocatechin-3-gallate;dopamine

2013-02-21；

2013-03-26

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（132777134）

吳艷芬（1978-），女，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事內(nèi)分泌疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:sunnywangwei@163.com

R743

A

1007-3205（2014）05-0501-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.003