非小細胞肺癌患者外周血中多參數檢測對診斷微轉移的作用

郝 穎 付秀華 王立紅 高俊珍

肺癌仍居全世界惡性腫瘤發病率和病死率的首位，手術切除仍是早期肺癌的首選方案[1]。隨著外科手術技巧的大幅提升，手術風險和圍手術期并發癥的發生率得到了明顯改善，但這并沒有同等程度延長肺癌患者術后生存的時間。據報道，醫院收治的可根治切除的Ⅰ期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者5年生存率約為60%～70%，但仍有部分患者死于肺癌的轉移或復發，生存率不容樂觀[2-3]。

NSCLC的高病死率歸因于腫瘤的轉移和復發，部分患者在診斷初期已經發生了微轉移。微轉移指惡性腫瘤細胞在發展過程中，播散并存活于淋巴道、外周血、骨髓及各種器官中尚未形成顯性轉移灶，轉移部位也無任何臨床表現，常規影像學和病理學等檢查均難以檢測發現的一種微量轉移特征。研究已發現多種與肺癌的發生發展密切相關的分子腫瘤標記物，包括細胞角蛋白家族、癌胚抗原、黏蛋白-1(MUC1)、EGFR、肺組織特異性X蛋白等。部分因子在腫瘤生物學行為中扮演了重要角色，有可能作為早期預測NSCLC患者術后是否轉移或復發的重要指標。本研究通過檢測NSCLC患者外周血中CK19、LunX、KS1/4的表達，探討其與NSCLC微轉移的關系。

材料與方法

一、病例資料

收集2010年2月至2012年5月內蒙古醫科大學附屬醫院心胸外科A、B病區行肺葉切除加淋巴結清掃術的非小細胞肺癌患者52例。術前均通過支氣管鏡或經皮肺穿刺、痰脫落細胞學等檢查病理證實為NSCLC，術前術后未經放、化療、靶向等抗腫瘤治療。選擇同期行局部支氣管擴張肺葉切除術、肺結核切除術、肺部錯構瘤切除手術的患者20例作為對照組。

二、實驗分組

入選患者分別于術后3個月、6個月和9個月復查胸部增強CT、腹部增強CT, 頭顱MRI、全身同位素骨掃描或PET-CT等檢查判斷是否發生轉移或復發。經隨訪后將52例患者再分為兩組，將發生腫瘤局部復發或遠處轉移的病例命名為轉移組，未發現腫瘤轉移或復發的病例命名為無轉移組。轉移組：共18例，其中男性13例，女性5例，平均年齡60.9±8.3歲；鱗癌9例，腺癌7例，黏液表皮樣癌1例，肺泡細胞癌1例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期8例。無轉移組：共34例，其中男性28例，女性6例，平均年齡(59.1±8.3)歲；鱗癌14例，腺癌10例，支氣管肺泡細胞癌4例，大細胞癌2例，混合型癌4例；Ⅰa～Ⅰb 期8例，Ⅱa～Ⅱb期10例，Ⅲa期16例。對照組：男性14例，女性6例，平均年齡(50.1±2.2)歲。

三、實驗方法

1.標本的采集及提取總RNA：采集肘靜脈新鮮外周血2 ml放入EDTA抗凝管中，迅速放入-80 ℃冰箱中保存備用。棄去開始的1 ml避免上皮細胞的污染。取抗凝血2 ml，以離心半徑8 cm，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，將4 ℃冰箱內預冷的紅細胞裂解液以6︰1的比例加入到細胞沉淀中，吹打混勻后靜置，以離心半徑8 cm，1000 r/min，離心5 min，收集沉淀部分，生理鹽水離心洗2次，收集沉淀，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA(北京天根生化科技公司，離心柱型，DP419)。

2. 反轉錄合成第一鏈cDNA：采用大連TAKARA公司PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser，按說明配制反應液體系1，冰上進行：5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、Total RNA 1 μg、余下為RNaseFree dH2O至總體積10 μl，42 ℃ 2 min后放入4 ℃保存；配制反應液體系2： 5×PrimeScript?Buffer 2 4 μl、PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl、RT primer Mix 1 μl、體系1 反應液 10 μl、RNaseFree dH2O至體系20 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃，反應結束后，cDNA放置-20 ℃保存備用。

3.熒光定量PCR反應：委托TAKARA生物技術公司完成引物序列的設計及合成，見表1。應用熒光定量PCR分析儀(美國ABI 7500fast)完成。按SYBR?Premix Ex Tap TM II (Perfect Real Time)(TAKARA Code: DRR081A)說明書完成反應體系的配制。

冰上配制PCR反應液：SYBR?Premix Ex TapTM Ⅱ(2×) 25 μl、PCR Forward Primer (10 μM)2.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μM) 2.0 μl、ROX Reference Dye II(50×)1.0 μl、cDNA 4.0 μl、d H2O 16.0 μl，95 ℃ 30 s滅活逆轉錄酶及預變性，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 CK19、LunX、KS1/4和GAPDH引物序列及擴增長度

四、統計學方法

結 果

經過隨訪，52例患者中發生轉移或復發共18例，轉移復發率34.6%(18/52)。

一、總RNA抽提結果

通過紫外分光光度儀檢測RNA純度，轉移組OD268/280值在1.612～1.98之間，RNA濃度在100～1370 μg/ml之間；未轉移組OD268/280值在1.732～2.1之間，RNA濃度在140～1020 μg/ml之間；良性病變組OD268/280值在1.800～2.0之間，RNA濃度在500～1410 μg/ml之間。經瓊脂糖膠電泳，紫外線燈下觀察可見2條清晰可見亮條帶，分別代表28 s和18 s，28 s亮度、寬度約為18 s條帶的2倍。

二、熒光定量PCR結果

根據擴增曲線記錄目標基因的平均CT值，即基因成指數擴增起始時所經歷的循環數。本實驗采用2-△△CT方法比較組織中各目標基因的表達差異,當擴增效率接近1時，可用2-△Ct表示目的基因在組織中的相對表達量(ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH)，ΔCt值與基因的表達量呈反比關系，ΔCt越低，提示基因表達量越高。GAPDH的CT值在15～25之間，目的基因產物的CT值在15～35之間，見圖1～8。

三、NSCLC轉移組、無轉移組與肺良性病變外周血標本中三種因子表達比較

外周血中CK19mRNA的ΔCt值在轉移組、無轉移組及對照組呈遞增關系，說明其CK19mRNA的表達量呈遞減趨勢，轉移組中CK19mRNA的表達量高于無轉移組及對照組，差異有統計學意義(P=0.038)；這種關系也同樣體現在LunX mRNA上，轉移組外周血中LunX mRNA的表達量高于無轉移組及對照組，差異有統計學意義(P=0.034)；KS1/4 mRNA的表達也同樣是這種趨勢，但P值并無統計學意義，見表2。

四、轉移組患者外周血中不同因子的表達差異

我們分別對轉移組外周血中三種因子的表達量做了比較，結果顯示LunXmRNA表達量最高，KS1/4mRNA 其次，CK19mRNA表達最低，差異具有統計學意義(P=0.004)，見表2。

表2 三組患者外周血標本三種因子ΔCt值表達比較

圖1 GAPDH熔解曲線 圖2 CK19熔解曲線 圖3 LunX熔解曲線 圖4 KS1/4熔解曲線

圖5 GAPDH擴增曲線 圖6 CK19擴增曲線 圖7 LunX擴增曲線 圖8 KS1/4擴增曲線

討 論

腫瘤的發生發展是一個復雜的生物過程，微轉移只是其中的一個階段，多種分子生物共同參與其發生和發展。腫瘤細胞從原發病灶脫落后，隨血運或淋巴管播散到新環境，但并非一定形成轉移灶。動物實驗表明經靜脈注射癌細胞后而只有0.01%最終形成了轉移灶，絕大部分進入血液循環的腫瘤細胞被機體免疫吞噬清除，循環內必須有大量腫瘤細胞播散后方有機會形成遠處轉移[4]。不可避免的是仍有部分早期癌癥患者要遭受腫瘤細胞的脈管侵犯，導致腫瘤的遠處轉移。張靜淵等[5]在研究中發現，腫瘤細胞的脈管內侵犯與腫瘤的胸膜浸潤、淋巴結轉移及遠處轉移密切相關(P<0.05)，但與年齡、腫瘤大小、分化程度無關(P>0.05)，提示腫瘤的脈管侵犯預示著遠處轉移的發生，較傳統的TNM分期能更早一步準確評估預后，而腫瘤脈管侵犯常與外周血中CK19mRNA表達呈正相關。

CK19是被廣泛研究并公認的腫瘤標記物之一，其在肺癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、乳腺癌、喉癌中的研究最多[6-10]。上皮細胞的過表達是腫瘤生物活動的主要表現形式，CK19為上皮細胞家族中的敏感性最高的片段，被認為與腫瘤的發生密切相關，血清檢測CK19片段診斷非小細胞肺癌的特異性達87%。Ge等[11]認為CK19 mRNA在NSCLC淋巴結中陽性表達可作為預測預后的獨立指標，并可作為肺癌臨床分期的補充。本研究的受試對象經術后隨訪發現腫瘤轉移或復發發生率為34.6%(18/52)。發生轉移組患者外周血中CK19mRNA的表達與未發生轉移組的差異有統計學意義，轉移組LunX mRNA在外周血的表達也明顯高于無轉移組，與CK19mRNA的表達基本一致，且兩組中CK19mRNA、LunX mRNA的表達均明顯高于對照組，差異有統計學意義。說明CK19和LunX與NSCLC轉移關系密切，部分NSCLC患者其實在手術治療前已經發生腫瘤細胞血液浸潤，CK19和LunX能在一定程度上預測轉移的發生。朱廣迎等[12]通過6～16個月的短期隨訪發現LunX基因表達陽性組復發和轉移率為52%，陰性組復發和轉移率僅為18%。而Yu等[13]認為LunX基因不僅能輔助診斷非小細胞肺癌，且對病理分型有指向性意義。牛瑞等[14]認為患者的生存時間與LunX mRNA的表達有相關性，這與我們的研究結果一致。CK19、LunX陽性表達一定程度上提示腫瘤負荷增加，預示微轉移的存在，術后發生轉移或復發的風險增加，可以作為診斷NSCLC微轉移的指標。

上皮癌相關基因(epithelial carcinoma-associated gene, KS1/4)是一種上皮細胞表面抗原，為超級免疫球蛋白家族中的黏著蛋白的一種[15-16]，因能結合多種不同單克隆抗體而被識別。KS1/4橫跨于細胞膜表面，在細胞增殖、成形過程中起粘連及細胞核信號傳導作用[17-18]。 KS1/4最初發現表達于結腸癌、胃腸癌、胰腺癌等上皮細胞內，后來許多研究在肺癌、前列腺癌、肝癌細胞中也檢測到KS1/4的陽性表達，故稱其為上皮癌相關基因。目前，KS1/4已經被認為是一種癌相關蛋白因子，通過癌細胞的跨膜蛋白水解[17, 19]和在干細胞信號轉導中發揮作用[20-22]。Mitas等[23]通過RT-PCR對NSCLC患者淋巴結LunX, KS1/4, CEA, CK19和MUC1做了檢測，首次提出KS1/4為診斷NSCLC特異性最高的標記物。Wallace等[24]采用RT-PCR檢測NSCLC患者淋巴結中LunX、MUCl。KS1/4, CEA, CK19 及 PSE的表達結果顯示，KS1/4的陽性表達率為25%，被認為是發現腫瘤微轉移最特異的基因。本實驗檢測外周血中KS1/4mRNA的表達發現，其在三組中的表達差異無統計學意義。我們推論KS1/4可能在腫瘤發生早期有一定生物學行為，尤其在淋巴結微轉移中發揮了作用，其在外周血的檢測診斷微轉移意義需重新定位。KS1/4可能在外周血內表達量低或不表達，或受其他因素影響而表達量降低，如是否存在競爭抑制等等，導致外周血中檢測陽性率低。

本研究還對轉移組內因子間的表達差異對了對比，結果顯示：轉移組外周血中LunXmRNA的表達最高，KS1/4mRNA其次，CK19mRNA的表達最低，差異有統計學意義(P=0.004)，提示LunX在外周血檢測診斷微轉移的特異性較KS1/4、CK19高。Mitas等[23]在實驗中應用實時定量 PCR 技術檢測 24 例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者外周血LUNX，MUC1, KS1/4, CEA，CK19 及 PSE 的表達，其中LUNX 陽性表達率最高, 為 42%，認為其特異性表達與肺癌的發生關系密切。這與我們的實驗結果符合，更進一步證實了我們的結論。

腫瘤細胞最終是否形成轉移與癌細胞的自身生物學行為、機體免疫及營養狀態、術式的選擇、淋巴結清掃情況、局部微循環等多因素共同參與有關。目前臨床應用TNM 分期為NSCLC患者做預后評價，微轉移的存在為分子分期(TNMB)提供了有力的依據。綜上所述，雖然本研究樣本例數偏少，但還是得到了與國外關于NSCLC微轉移的多項研究相似的結論，因此，我們認為CK19、LunX可以作為預測NSCLC轉移或復發的指標，輔助診斷NSCLC微轉移，其中LunX的敏感性略顯優勢。

參 考 文 獻

1 錢桂生. 肺癌不同病理類型發病率的變化情況及原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2011，4(1)：1-6.

2 Matsuoka K, Sumitomo S, Nakashima N, et al. Prognostic value of carcinoembryonic antigen and CYFRA21-1 in patients with pathological stage I non-small cell lung cancer[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2007, 32(3): 435-439.

3 Maruyama R, Sugio K, Mitsudomi T, et al. Relationship between early recurrence and micrometastases in the lymph nodes of patients with stage I non-small-cell lung cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1997, 114(4): 535-543.

4 Mitas M, Mikhitarian K, Walters C, et al. Quantitative real-time RT-PCR detection of breast cancer micrometastasis using a multigene marker panel[J]. Int J Cancer, 2001, 93(2): 162-171.

5 張靜淵, 尹 榮, 徐新宇. 非小細胞肺癌的脈管內侵犯與微轉移、微血管密度關系的研究[J]. 南京醫科大學學報(自然科學版), 2013, (07): 887-891.

6 陳玉敏, 王金林, 師鎖江, 等. 胃癌患者外周血中CK-19的表達及其臨床意義[J]. 中國醫藥導報, 2013, 10(14): 4-6, 10.

7 吳 蔚, 胡國華, 康苧心, 等. CK19和EGFR mRNA在喉癌動物模型外周血中的表達及其與淋巴轉移關系[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2011, 25(11): 501-505.

8 余 輝, 黃秀英, 王 欣, 等. 非小細胞肺癌患者外周血CK19 mRNA檢測臨床意義的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2011, 18(13): 1024-1026.

9 孟慶翔, 謝景華, 高雄輝, 等. 喉癌患者治療前后外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達及臨床意義[J]. 中國癌癥防治雜志, 2011, 18(4): 302-305.

10 張 俊, 曾照芳. CK-19 mRNA對乳腺癌的微轉移診斷價值的Meta分析[J]. 激光雜志, 2012, (02): 77-78.

11 Ge MJ, Wu QC, Wang M, et al. Detection of disseminated lung cancer cells in regional lymph nodes by assay of CK19 reverse transcriptase polymerase chain reaction and its clinical significance[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2005, 131(10): 662-668.

12 朱廣迎, 陳 杰. 肺癌患者三種微轉移標志物臨床意義的比較研究[J]. 中華放射腫瘤學雜志, 2003, 12 (3): 41-45.

13 Yu H, Huang X, Zhu Z, et al. Significance of combined detection of LunX mRNA and tumor markers in diagnosis of lung carcinoma[J]. CHINESE J CANCER RES, 2014, 26(1): 89-94.

14 牛 瑞, 劉 波, 邵明舉, 等. 非小細胞肺癌區域淋巴結中肺組織特異性基因的表達與預后的關系[J]. 山東大學學報(醫學版), 2007, 45 (9): 882-885.

15 Cavallaro U, Christofori G. Cell adhesion and signalling by cadherins and Ig-CAMs in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2004, 4(2): 118-132.

16 Litvinov SV, Bakker HA, Gourevitch MM, et al. Evidence for a role of the epithelial glycoprotein 40 (Ep-CAM) in epithelial cell-cell adhesion[J]. Cell Adhes Commun, 1994, 2(5): 417-428.

17 Maetzel D, Denzel S, Mack B, et al. Nuclear signalling by tumour-associated antigen EpCAM[J]. Nat Cell Biol， 2009， 11(2): 162-171.

18 Carpenter G, Red BM. EpCAM: another surface-to-nucleus missile[J]. Cancer Cell, 2009, 15(3): 165-166.

19 Trzpis M, Bremer E, McLaughlin PM, et al. EpCAM in morphogenesis[J]. Front Biosci, 2008, 13: 5050-5055.

20 Gonzalez B, Denzel S, Mack B, et al. EpCAM is involved in maintenance of the murine embryonic stem cell phenotype[J]. Stem Cells, 2009, 27(8): 1782-1791.

21 Ng VY, Ang SN, Chan JX, et al. Characterization of epithelial cell adhesion molecule as a surface marker on undifferentiated human embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2010, 28(1): 29-35.

22 Munz M, Baeuerle PA, Gires O. The emerging role of EpCAM in cancer and stem cell signaling[J]. Cancer Res, 2009, 69(14): 5627-5629.

23 Mitas M, Cole DJ, Hoover L, et al. Real-time reverse transcription-PCR detects KS1/4 mRNA in mediastinal lymph nodes from patients with non-small cell lung cancer[J]. Clin Chem, 2003, 49(2): 312-315.

24 Wallace MB, Block MI, Gillanders W, et al. Accurate molecular detection of non-small cell lung cancer metastases in mediastinal lymph nodes sampled by endoscopic ultrasound-guided needle aspiration[J]. Chest, 2005, 127(2): 430-437.